CRISPRi介导的GPD基因滴定对酿酒酵母（S. cerevisiae）发酵性能的影响

《ACS Synthetic Biology》：Impact of CRISPRi-Mediated Titration of GPD Genes on the Fermentative Performance of S. cerevisiae

甘油代谢调控对乙醇生产力的影响及CRISPRi技术优化研究。

　　甘油是乙醇发酵过程中乙醇生产的主要副产物之一，其在酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）中的作用不仅体现在维持细胞的氧化还原平衡，还与细胞对渗透压胁迫的响应密切相关。然而，甘油的生成会将部分碳源从乙醇合成途径中分流，从而影响乙醇的产量。因此，传统的基因编辑技术已被用于调控甘油合成途径中的相关基因。但这类方法往往导致不理想的表型，不利于工业应用。本研究采用CRISPR-dCas9系统对*GPD1*和*GPD2*这两个主要参与该代谢过程的基因进行适度下调表达，成功实现了对甘油产量的分级调控。实验结果表明，通过CRISPRi技术调控*GPD*基因表达，相较于单一基因敲除细胞，能够获得更高的单位乙醇生产率（SEP），同时保持酵母的生长能力。此外，针对*GPD1*基因在转录起始位点（TSS）上游-140个碱基对处的调控，使得乙醇产量比野生型和*gpd1Δ*菌株分别提高了3%。结合*GPD2*基因的敲除，该调控策略显著提升了SEP，同时在高浓度糖发酵（VHG）条件下保持了酵母对高渗透压的耐受性。

### 甘油合成与乙醇生产的关系

在工业乙醇生产过程中，酿酒酵母作为主要的生物工厂，其乙醇转化效率是决定生产效益的关键因素之一。目前，酵母的乙醇产量已接近理论最大值的90%–94%，但其发酵效率仍受多种因素影响，包括细胞代谢调控和碳源分配。在发酵过程中，葡萄糖会被分解为丙酮酸，进而转化为乙醇和二氧化碳。然而，这一过程会产生大量NADH，需通过代谢途径进行平衡。甘油的合成路径中，NADH依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH）在将二羟基丙酮磷酸（DHAP）转化为甘油-3-磷酸（G3P）过程中起关键作用。G3P随后被ATP依赖的甘油-3-磷酸磷酸酶脱磷酸化，生成甘油，同时消耗ATP并将NADH转化为NAD?。这一过程不仅影响乙醇的产量，还对细胞的生长和代谢具有重要影响。

### CRISPR-dCas9技术在代谢调控中的应用

传统基因编辑方法如基因敲除虽然能够有效减少甘油的生成，但往往伴随着细胞生长受限或其他不理想的表型。为了在不破坏酵母基本生理功能的前提下实现对甘油合成路径的调控，本研究采用了CRISPR-dCas9系统。该系统通过将非催化性的dCas9蛋白与调控因子（如Mxi1）结合，利用引导RNA（sgRNA）靶向特定基因，从而实现对基因表达的调控。这种方法可以在不切割DNA的情况下调节基因表达，具有更高的灵活性和可逆性。

本研究选择了*GPD1*和*GPD2*基因作为调控目标，并在每个基因的启动子区域选取了四个不同的靶点，分别对应不同的sgRNA序列。通过CRISPRi技术，研究人员成功实现了对这两个基因的表达下调，同时避免了完全敲除所带来的生长缺陷。结果显示，*GPD2*基因的下调和*GPD1*基因的靶向调控能够有效减少甘油的生成，而不会显著影响酵母的生长。这表明CRISPRi技术在调控甘油合成路径方面具有独特优势。

### 不同靶点对基因表达和代谢的影响

在实验中，研究人员分析了不同靶点对*GPD1*和*GPD2*基因表达水平的影响。结果显示，针对*GPD1*基因的靶点选择对基因表达的调控效果较为显著，尤其是在距离TSS较近的区域。而*GPD2*基因的调控效果则相对稳定，其表达水平在所有靶点中均呈现相似的下调趋势。这一现象可能与*GPD2*基因在酵母细胞中的生理角色有关，其表达主要受细胞内NAD?/NADH比例的影响，而在非发酵条件下，其表达水平可能不会受到显著影响。

此外，研究人员还分析了不同靶点对酵母代谢产物（如甘油和乙醇）的影响。结果显示，针对*GPD1*基因的调控在某些情况下反而提高了甘油的产量，这可能与*GPD1*基因在呼吸代谢中的作用有关。而*GPD2*基因的调控则主要影响了细胞的生长和乙醇的产量。这些结果表明，CRISPRi技术对不同基因的调控效果存在差异，需要根据具体目标基因和调控策略进行优化。

### CRISPRi与基因敲除的结合

为了进一步提高乙醇产量，研究人员还尝试将CRISPRi技术与基因敲除结合。例如，在*gpd1Δ*菌株中，通过CRISPRi技术对*GPD2*基因进行调控，显著降低了甘油的生成，同时提高了SEP。这一策略能够在不完全丧失甘油合成能力的前提下，实现对碳流的重新分配，从而提高乙醇产量。同样，在*gpd2Δ*菌株中，对*GPD1*基因的调控也显示出类似的效果。这种组合策略不仅提高了乙醇的产量，还保持了酵母的生长能力，使其能够在高渗透压条件下维持正常的发酵性能。

### 甘油调控对酵母渗透压耐受性的影响

甘油在酵母细胞中扮演着重要的渗透压调节角色，其合成能力直接影响细胞在高浓度糖环境下的存活能力。传统基因敲除方法可能会导致酵母在高渗透压条件下生长受限，而本研究通过CRISPRi技术对*GPD1*基因进行调控，成功获得了在VHG发酵条件下仍能保持高渗透压耐受性的菌株。这表明，通过CRISPRi技术实现对*GPD1*基因的适度下调，可以在不影响酵母渗透压响应能力的前提下，提高乙醇的产量。

### 代谢调控的复杂性与应用前景

本研究揭示了CRISPRi技术在调控酵母代谢中的潜力，特别是在甘油合成路径的优化方面。通过选择不同的靶点，研究人员能够实现对甘油产量的精确调控，同时保持酵母的生长能力和渗透压耐受性。这种调控策略不仅有助于提高乙醇的产量，还为未来的代谢工程提供了新的思路。此外，实验结果还表明，CRISPRi技术对不同基因的调控效果存在差异，这提示在实际应用中，需要根据目标基因的功能和调控需求进行定制化设计。

### 未来研究方向

尽管本研究已经取得了一些重要的成果，但仍然存在一些需要进一步探索的问题。例如，不同靶点对基因表达的调控效果可能受到多种因素的影响，包括染色质结构、调控因子的结合效率以及细胞内其他代谢途径的反馈调控。此外，CRISPRi技术在工业酵母菌株中的应用仍需进一步优化，以提高其稳定性和适用性。未来的研究可以聚焦于这些方面，例如开发更稳定的基因编辑策略、探索不同调控因子的组合效果，以及研究CRISPRi对酵母整体代谢网络的影响。这些研究将进一步推动代谢工程在工业生物技术中的应用，提高乙醇生产的效率和经济性。