辅助亚基调控苯基琥珀酸合成酶中硫基自由基的形成

《Biochemistry》：Accessory Subunit Regulates Thiyl Radical Formation in Benzylsuccinate Synthase

苯甲基琥珀酸合酶（BSS）的γ和β亚基结构解析及催化机制优化研究。通过晶体结构分析发现BSSγ具有HiPP-like折叠结构并整合[4Fe-4S]簇，BSSβ通过调控构象促进thiyl自由基形成，优化β亚基浓度和添加时序将总转化数提升至17000，催化剂寿命延长至11天。

　　在生物化学领域，X-琥珀酸合成酶（XSSs）是一类重要的甘氨酰基自由基酶（GREs），它们能够催化厌氧条件下碳氢化合物的功能化反应，使厌氧微生物能够利用石油衍生的底物进行代谢。由于其能够对原油成分进行功能化并催化选择性烯烃的氢烷基化反应，XSSs在生物技术领域展现出巨大的应用潜力。然而，由于长期无法在体外安装其关键的甘氨酰基自由基辅因子，导致对XSSs作用机制的理解受到限制，这一难题直到最近才得以解决。

与大多数GREs不同，XSSs包含与催化亚基结合的辅助亚基。目前研究最为深入的XSS是苯基琥珀酸合成酶（BSS），它包含两个[4Fe–4S]簇结合的辅助亚基：BSSγ和BSSβ。尽管BSSγ的完整结构和BSSβ的催化作用一直不清楚，但本研究通过解析BSSγ的晶体结构，首次揭示了其[4Fe–4S]簇的存在，并发现其折叠方式与BSSβ相似，具有HiPP-like结构。进一步的生化和光谱研究表明，BSSβ能够促进硫自由基（Cys·）的形成，即使在没有底物的情况下也能实现这一过程。这一发现与近期提出的模型相悖，后者认为底物结合是触发硫自由基形成的必要条件。

通过这一机制的深入理解，我们优化了反应条件，实现了总周转数（TTN）达到约17,000，相较于以往的报告提升了超过340倍。此外，我们还发现，在没有BSSβ的情况下，激活的BSSαγ仍能保持催化活性长达11天。这些结果不仅澄清了BSS独特的调控结构，也为XSSs在生物催化应用中的开发奠定了基础。

在这一研究中，我们还构建了一个能够直接比较甘氨酰基自由基（Gly·）和硫自由基（Cys·）状态的系统，这为研究体外自由基的持久性以及自由基转移对催化剂寿命的影响提供了重要平台。虽然硫自由基从未在任何GRE中被直接观察到，但甘氨酰基自由基在这些酶中的存在已被广泛通过电子自旋共振（EPR）光谱进行研究。通常情况下，EPR光谱显示一个来自Gly·的双峰信号，表明自由基平衡偏向于甘氨酰基自由基状态。这一现象与已知的甘氨酸和半胱氨酸的还原电位和键解离能相一致。尽管Gly·的长寿命是GREs的一个显著特征，但其在体外的寿命很少被测量，且会受到反应条件的显著影响。

在对BSSβ的进一步研究中，我们通过基因工程手段生成了两个BSSβ变体：BSSβ-ΔCterm（缺失C端残基）和BSSβ-ΔFeS（通过C29S突变破坏[4Fe–4S]簇结合）。这些变体在表达和纯化过程中表现出不同的特性，BSSβ-ΔFeS由于缺乏[4Fe–4S]簇而容易发生蛋白酶解，因此无法获得其全长形式。通过EPR光谱和氢氘交换实验，我们发现BSSβ-ΔCterm在促进硫自由基形成方面的作用显著降低，而BSSβ-ΔFeS则完全丧失这一功能。这些结果进一步支持了BSSβ的C端可能在调控甘氨酰基自由基域（GRD）构象变化中的作用，从而影响硫自由基的形成。

此外，我们还发现，BSSβ的存在不仅影响催化活性，还显著提高了反应的一致性和催化剂寿命。通过调整BSSβ的浓度和添加顺序，我们实现了总周转数的大幅提升，同时将催化剂负载量从2 mol%降至0.01 mol%，并保持超过90%的产率。这种优化对于将这些酶应用于生物工程和生物催化具有重要意义。

本研究的发现表明，BSSβ在催化过程中扮演着关键角色，它能够促进硫自由基的形成，即使在没有底物的情况下也能实现这一过程。这种机制可能解释了为什么BSSβ在体外催化中对催化剂寿命有显著影响。通过进一步的实验和数据分析，我们发现BSSβ可能通过某种方式加速硫自由基的形成，从而导致非产率性的自由基淬灭，使催化剂失活。这些结果不仅加深了我们对BSS催化机制的理解，也为XSSs在生物催化领域的应用提供了新的思路和方向。

总的来说，本研究通过解析BSSγ的晶体结构，揭示了其与BSSβ相似的折叠方式，为理解GREs的结构和功能提供了重要依据。同时，通过生化和光谱实验，我们发现了BSSβ在促进硫自由基形成中的关键作用，这一发现为优化反应条件和提高催化剂性能提供了新的策略。这些成果不仅对GREs的机制研究具有重要意义，也为未来生物催化技术的发展奠定了坚实的基础。