直接测量Mavacamten和脱氧ATP对猪心肌肌原纤维SRX/DRX比例的扰动：一种简便、易得且可多重分析的新方法

《Journal of Muscle Research and Cell Motility》：Direct measurement of mavacamten and deoxyATP perturbation of the SRX/DRX ratio in porcine cardiac myofibrils using a simple, accessible and multiplexed approach

本研究针对心肌能量调控中肌球蛋白超松弛态(SRX)与失序松弛态(DRX)比例难以直接量化的问题，开发了一种基于Cy3-ATP荧光成像的脉冲追踪技术。研究人员通过保留肌小节结构的猪心肌肌原纤维模型，证实脱氧ATP(dATP)可显著消耗心脏储备(DRX增至84.8%)，而临床药物Mavacamten则能扩大SRX储备(DRX降至5.2%)。该技术为心脏能量代谢调控机制研究和心肌病药物开发提供了重要工具。

　　

心脏如同一个永不停歇的泵，在人的一生中持续搏动。这种非凡的耐力背后，隐藏着精妙的能量调控机制。心肌细胞中的肌球蛋白（Myosin）II分子马达，通过水解ATP（三磷酸腺苷）产生力量，驱动心脏收缩。然而，在静息状态下，如果所有肌球蛋白都保持活跃，将造成巨大的能量浪费。那么，心脏是如何实现“按需分配”，在需要时调动更多马达工作，在闲时让它们“休眠”以节省能量的呢？

这一谜题的答案，逐渐聚焦于肌球蛋白的两种特殊状态：失序松弛态（Disordered-Relaxed State, DRX）和超松弛态（Super-Relaxed State, SRX）。DRX状态的肌球蛋白具有较低的ATP酶活性，而SRX状态则是一个更深的“休眠”状态，其ATP周转速率极慢，构成了心脏的肌球蛋白储备池。准确测量SRX/DRX的比例，对于理解心脏如何适应生理需求变化（如运动、应激）以及病理状态下（如心力衰竭、肥厚型心肌病）的能量代谢失衡至关重要。

早期由Cooke实验室开创的技术，使用MANT-ATP（甲基蒽醌标记的ATP）并通过荧光光谱法测量其从肌纤维中的释放，首次揭示了SRX状态的存在。然而，这类方法或依赖于复杂的单分子成像，耗时耗力；或使用传统的停流光谱技术，可能无法完全反映肌原纤维在近乎生理的肌小节结构中的真实情况。此外，近期研究对MANT-ATP检测中观察到的双相释放是否真实反映了SRX和DRX的平衡提出了质疑。因此，领域内迫切需要一种能够在保留肌丝骨架结构的前提下，快速、可靠且直接地量化SRX/DRX比例的方法。

为了解决这一技术瓶颈，由Neil M. Kad领导的研究团队在《Journal of Muscle Research and Cell Motility》上发表了一项研究，他们建立了一种基于荧光显微镜的简易方法，直接观测荧光标记的ATP（Cy3-ATP）在猪心肌肌原纤维中的释放动力学。该方法巧妙地利用了分离的肌原纤维的高渗透性，使得溶液交换可以在亚毫秒级别完成，从而能够执行精确的脉冲-追踪实验。研究人员应用此技术，探究了两种重要的生化调节因子——脱氧ATP（dATP）和心肌肌球蛋白抑制剂Mavacamten——对SRX/DRX比例的扰动，为心脏储备的调控提供了新的见解。

研究人员主要运用了几项关键技术：首先，从猪左心室小梁中分离并纯化出保持完整肌小节结构的心肌肌原纤维。其次，构建微流控细胞，将肌原纤维固定于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面，以实现快速的溶液交换。核心实验技术是荧光成像脉冲追踪法：先将肌原纤维与Cy3-ATP和未标记ATP的混合液孵育，使其与肌球蛋白结合饱和，然后快速冲洗掉游离的Cy3-ATP，并注入高浓度的未标记ATP进行“追踪”。在此过程中，使用斜角荧光显微镜，以间隔5秒的短暂激光脉冲（15毫秒）采集肌原纤维的荧光图像，持续30分钟，以监测结合在肌球蛋白上的Cy3-ADP的释放过程。为了提升效率，他们还搭建了一个自动化的载物台系统，可以在一次实验中对多达四个肌原纤维进行多重成像。最后，对获得的荧光衰减曲线进行指数拟合分析，以确定不同速率常数对应的肌球蛋白群体比例。

结果：方法建立与验证

研究人员首先验证了新方法的可靠性。肌原纤维在洗去Cy3-ATP后，其荧光强度随时间衰减。如图1b所示，衰减曲线最优地拟合为三重指数函数。最快的相位（速率常数>0.041 s^-1）可能源于Cy3-ATP冲洗的残留、肌动蛋白诱导的ADP释放和/或核苷酸的非特异性结合，因此在后续分析中被忽略。而剩余的两个较慢相位，其速率常数范围与文献中报道的DRX状态（0.041 > k > 0.007 s^-1）和SRX状态（k < 0.007 s^-1）相符。为了客观界定这两个状态，他们对所有未经处理的肌原纤维数据点的速率常数与群体百分比进行了高斯混合模型分析。该模型清晰地识别出两个主要的概率密度集群（图2a），并以99.95%的概率密度边界作为DRX和SRX的分界线。据此，测得DRX和SRX的平均速率常数分别为0.021 s^-1和0.0021 s^-1。未经处理的肌原纤维中，DRX群体约占68.0%，SRX约占32.0%，这表明在基础状态下，大部分肌球蛋白处于准备就绪的DRX状态，但仍存在相当比例的能量节约SRX状态。

结果：Mavacamten和dATP的扰动效应

为了证实该方法能有效检测SRX/DRX比例的变化，研究人员使用了两种作用相反的调节剂。Mavacamten是一种FDA批准的治疗梗阻性肥厚型心肌病的药物，已知能将肌球蛋白推向更不活跃的状态。而dATP则被证明可以激活肌球蛋白。

实验结果与预期完全一致（图2b, c）。当用含有30μM Mavacamten的追踪溶液进行冲洗时，绝大多数肌原纤维仅表现出SRX状态的单一慢速释放相位，DRX群体比例显著下降至5.2%。相反，当使用100% dATP（5 mM）作为追踪核苷酸时，大部分肌原纤维的荧光衰减表现为单一的快速DRX相位，DRX群体比例增加至84.8%，其中三个样本甚至完全观察不到SRX群体。值得注意的是，Mavacamten存在下的SRX速率常数与基础状态下无显著差异，这表明Mavacamten的作用机制可能是将肌球蛋白从DRX状态“驱赶”到一个预先存在的、定义明确的SRX状态，而非改变SRX状态本身的生化特性。这些结果与之前使用其他技术（如停流光谱）在猪肌原纤维中获得的数据高度一致，证明了该新方法的有效性和准确性。

结论与意义

本研究成功开发并验证了一种基于肌原纤维Cy3-ATP荧光成像的简便技术，用于直接量化心肌肌球蛋白的SRX/DRX比例。该方法结合了肌原纤维保留天然肌丝结构的优点和溶液快速交换的能力，在复杂的单分子成像和传统的体相光谱学方法之间找到了一个理想的平衡点。

研究结果明确证实，Mavacamten能几乎完全消除DRX状态，将肌球蛋白锁定在节能的SRX状态，这与其降低心肌收缩力的临床疗效相符。而dATP则能大量消耗SRX储备，使肌球蛋白处于更易于被激活的DRX状态，这解释了其增强心肌收缩力的作用。因此，该技术能够可靠地测量SRX/DRX比例在整个可能范围内的变化。

这项技术的意义在于其易用性和普适性。它为未来研究提供了一个强大的工具，可用于评估来自患者（如携带致病突变）或干细胞分化的各种心肌样本中SRX/DRX比例的变化，也可用于高通量筛选能够调节这一比例的新化合物。更重要的是，该研究再次引发了关于SRX/DRX比例如何被精确调控的深入思考。观察到的两个明确分离的动力学状态表明，在松弛的心肌中，SRX和DRX是相对稳定的，它们之间的快速互换会导致单一平均速率。这种稳定性的维持可能源于肌球蛋白自身的结构（如相互作用头模构象），也可能受到粗丝内其他蛋白（如肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）和肌联蛋白（Titin））的相互作用调控，这些蛋白可能是机械负荷和磷酸化等信号传导的介质。

总之，这项研究不仅提供了一种直接测量心脏能量储备的新方法，而且加深了我们对心肌适应性和药物作用分子基础的理解。随着技术的进一步优化（如通过商业自动化实现更高程度的多重化），它有望在心脏生理、疾病机制研究和药物开发领域发挥重要作用，最终为解开心脏能量消耗之谜做出贡献。