髓系肿瘤体细胞变异检测中参考样本类型的优化评估：T细胞作为精准医疗的黄金标准

《Annals of Hematology》：Evaluation of reference sample type for somatic variant calling in myeloid cancers

本刊推荐：为解决髓系肿瘤体细胞变异检测中参考样本选择难题，研究人员开展了一项系统性评估研究，比较了T细胞、皮肤活检组织、唾液及肿瘤单独分析在WES中的表现。结果显示T细胞参考样本展现出最高灵敏度(0.91-1.00)和最低假阳性率，为临床精准医疗提供了可靠的技术方案。该研究为优化NGS检测流程提供了重要循证依据。

　　

在精准医疗时代，高通量测序技术正在重塑癌症诊疗格局。特别是在髓系肿瘤领域，基因谱分析为疾病机制解析、风险分层和治疗决策提供了关键依据。然而，准确识别疾病驱动性的体细胞变异面临着一个基础性挑战：如何选择最合适的正常参考样本进行背景对照。由于髓系肿瘤起源于早期髓系祖细胞，其突变可能存在于全身多种含有髓系来源细胞的组织中，这导致常规参考样本可能存在肿瘤DNA污染风险，直接影响变异检测的准确性。

传统上，纤维母细胞培养被视为遗传性血液肿瘤诊断的"金标准"，但其耗时数周的培养周期与临床急需治疗决策的时间要求存在显著矛盾。面对这一困境，丹麦奥尔堡大学医院的研究团队在《Annals of Hematology》上发表了创新性研究，系统评估了四种潜在参考样本类型的性能表现，为优化临床检测流程提供了重要证据。

研究团队通过前瞻性队列设计，纳入7例符合WHO诊断标准的髓系肿瘤患者，采集骨髓来源的T细胞、皮肤活检组织、唾液样本以及培养的纤维母细胞，进行Illumina双端全外显子组测序。采用内部开发的生物信息学流程，以肿瘤-纤维母细胞配对分析为基准，全面比较各参考样本的灵敏度、假阳性率和漏检变异情况。

关键技术方法包括：7例髓系肿瘤患者的多类型生物样本采集（骨髓T细胞、皮肤活检、唾液、纤维母细胞）；Illumina平台全外显子组测序（平均覆盖度肿瘤样本344×，参考样本189×）；以纤维母细胞为基准的变异调用性能评估体系；针对克隆性造血相关基因的特异性分析。

灵敏度比较分析

研究结果显示，肿瘤单独分析和T细胞参考表现出卓越的检测灵敏度，范围均为0.91-1.00。其中肿瘤单独分析检测到的真实阳性变异数量最多，但这是以牺牲特异性为代价的。相比之下，皮肤活检和唾液样本呈现出显著的不稳定性：皮肤活检灵敏度分布离散（0.00-1.00），而唾液样本表现两极分化，三个病例出现22-30个变异漏检，另两个病例却达到完美灵敏度1.00。这种不一致性很可能源于样本采集过程中白细胞污染导致的肿瘤DNA混杂。

假阳性变异分析

当深入分析检测特异性时，肿瘤单独分析的局限性暴露无遗。该方案产生了大量假阳性变异（中位数309个），假阳性与真实阳性比值高达14:1，这些变异主要来源于生殖系变异误判，其平均变异等位基因频率(VAF)为0.54-0.59，符合生殖系变异特征。相比之下，T细胞参考仅产生少量假阳性（平均1.5个，假真比0.02），皮肤活检和唾液分别为3.2个（0.17）和1.3个（0.63）。

特殊病例深度解析

在两个特殊病例中，研究人员观察到3个被T细胞参考漏检但被肿瘤单独分析正确识别的变异。通过整合基因组浏览器(IGV)手动检查发现，T细胞样本中存在低水平变异支持读数，但这些位点均未映射到已知的克隆性造血相关基因，其起源仍待进一步探索。值得注意的是，在确实体细胞变异位点也观察到类似的低频信号，但由于T细胞中VAF显著低于肿瘤样本，确保了正确的体细胞分类。

研究结论明确指出，T细胞参考在准确性与实用性之间达到了最佳平衡。其高灵敏度、低假阳性率以及可与流式细胞术同步进行的采集便利性，使其成为髓系肿瘤体细胞变异检测的首选方案。虽然极少数情况下可能存在克隆性造血相关变异的干扰，但通过设置肿瘤与正常样本的VAF比值阈值，可有效提高生物信息学流程的敏感性。

对于临床实践而言，这项研究提供了明确的指导：当需要快速诊断时，T细胞参考是最可靠的选择；而当无法获取参考样本时，肿瘤单独分析结合选择性过滤策略（如限定临床关注的肿瘤基因列表）也可作为可行替代方案。这种分层策略既满足了临床决策的时效性要求，又保证了检测结果的可靠性，为个性化治疗时代的基因组分析建立了优化工作流程。

该研究的创新性在于首次使用纤维母细胞作为基准系统评估多类型参考样本，为髓系肿瘤的精准诊断提供了等级证据。未来研究方向可能包括扩大样本量验证、探索不同疾病负荷下的表现差异，以及开发更高效的生物信息学过滤算法。这些进展将共同推动血液肿瘤基因组学向更精准、更实用的临床转化迈进。