FOXM1/NEDD4L轴调控EGFR蛋白稳定性在肺腺癌生长和奥希替尼耐药中的机制研究

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Activating NEDD4L suppresses EGFR-driven lung adenocarcinoma growth via facilitating EGFR proteasomal degradation

本研究针对EGFR突变肺腺癌(LUAD)中奥希替尼耐药的关键科学问题，揭示了FOXM1/NEDD4L信号轴通过调控EGFR蛋白稳定性影响肿瘤进展的新机制。研究发现转录因子FOXM1直接抑制E3泛素连接酶NEDD4L的转录表达，导致EGFR（包括奥希替尼敏感/耐药突变体）蛋白稳定性增强，从而促进LUAD生长。尤为重要的是，研究首次发现临床批准药物维替泊芬(verteporfin)可作为FOXM1抑制剂，通过激活NEDD4L介导的EGFR泛素化降解，显著抑制肿瘤生长并与奥希替尼产生协同抗肿瘤效应。该研究为克服EGFR-TKI耐药提供了新的治疗策略和潜在临床转化价值。

　　

在肺癌治疗领域，表皮生长因子受体(EGFR)突变型肺腺癌(LUAD)的靶向治疗取得了显著进展，尤其是第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)奥希替尼(osimertinib)已成为一线治疗选择。然而，获得性耐药仍是临床面临的主要挑战，其中EGFR C797S突变和EGFR扩增是常见的耐药机制。目前，针对这些耐药机制的有效治疗策略仍然有限。

传统上，EGFR-TKI主要通过抑制激酶活性发挥作用，而调控EGFR蛋白稳定性可能成为克服耐药的新途径。蛋白质稳态的维持依赖于复杂的调控网络，其中泛素-蛋白酶体系统是关键环节。E3泛素连接酶能够特异性识别底物蛋白并促进其泛素化降解，但EGFR在LUAD中的特异性E3连接酶及其调控机制尚不清楚。

针对这一科学问题，研究人员在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了一项突破性研究，系统阐明了FOXM1/NEDD4L轴在调控EGFR蛋白稳定性和LUAD进展中的关键作用。研究发现神经前体细胞表达发育调控下调4样(NEDD4L)是EGFR的新型E3泛素连接酶，而叉头框蛋白M1(FOXM1)作为上游转录因子抑制NEDD4L表达，从而稳定EGFR蛋白并促进肿瘤生长。更为重要的是，研究首次发现FDA已批准药物维替泊芬能够抑制FOXM1，激活NEDD4L介导的EGFR降解，为克服奥希替尼耐药提供了新颖的治疗策略。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过生物信息学分析筛选候选E3连接酶；利用细胞系(包括奥希替尼敏感/耐药LUAD细胞)进行基因操作(过表达/敲低)和功能验证；采用免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光等技术验证蛋白相互作用；建立细胞移植瘤(CDX)和转基因小鼠模型进行体内验证；通过染色质免疫沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验验证转录调控关系；并利用虚拟筛选和分子对接技术筛选FOXM1抑制剂。

NEDD4L促进EGFR蛋白泛素化和蛋白酶体降解

研究团队首先通过临床数据分析发现，EGFR扩增与第三代EGFR-TKI治疗的不良预后相关。利用UbiBrowser数据库预测，NEDD4L被鉴定为潜在的EGFR E3泛素连接酶。实验证实NEDD4L过表达能显著降低野生型和多种奥希替尼敏感/耐药EGFR突变体(包括EGFR^19del、EGFR^L858R、EGFR^T790M、EGFR^C797S等)的蛋白水平。通过环己酰亚胺(CHX)追踪实验发现，NEDD4L过表达显著缩短了EGFR蛋白的半衰期。泛素化分析显示，NEDD4L促进EGFR的多泛素化修饰，而蛋白酶体抑制剂MG132处理能够逆转NEDD4L介导的EGFR降解，证实了蛋白酶体途径的参与。

NEDD4L与EGFR直接相互作用

免疫荧光显示NEDD4L与野生型EGFR、EGFR^19del和EGFR^L858R/T790M在细胞中共定位。免疫共沉淀实验进一步证实NEDD4L不仅能与野生型EGFR结合，还能与多种奥希替尼敏感/耐药EGFR突变体相互作用。通过生物信息学分析和结构域映射实验，研究人员发现EGFR胞内结构域(ICD)和NEDD4L的HECT结构域是介导两者相互作用的关键区域。

NEDD4L通过降低EGFR蛋白表达抑制LUAD生长

功能实验表明，NEDD4L过表达显著抑制LUAD细胞增殖，而NEDD4L敲低则促进细胞生长。EGFR敲低可逆转NEDD4L敲低引起的促增殖效应。在体内实验中，NEDD4L过表达显著抑制了H1975OR细胞(携带EGFR^{L858R/T790M/C797S}突变)移植瘤的生长。在可诱导的EGFR^19del/T790M转基因小鼠模型中，NEDD4L过表达也能有效抑制EGFR突变驱动的肺肿瘤形成，并降低EGFR和磷酸化EGFR(p-EGFR)蛋白水平。

FOXM1转录抑制NEDD4L表达

通过生物信息学分析，研究人员发现FOXM1是NEDD4L的潜在上游转录因子。实验证实FOXM1敲低显著上调NEDD4L的mRNA和蛋白水平。ChIP和双荧光素酶报告基因实验证明FOXM1直接结合到NEDD4L启动子特定区域(-1515至-1506 bp)，并抑制其转录活性。NEDD4L敲低可逆转FOXM1敲低引起的EGFR和p-EGFR蛋白水平下降。

FOXM1通过抑制NEDD4L促进EGFR驱动型LUAD生长

功能实验显示，FOXM1敲低抑制LUAD细胞增殖，而NEDD4L敲低可逆转此效应。在移植瘤模型中，FOXM1敲低抑制肿瘤生长，NEDD4L敲低则促进肿瘤生长，且NEDD4L敲低能恢复FOXM1敲低引起的肿瘤生长抑制。在转基因小鼠模型中，FOXM1抑制剂FDI-6治疗显著抑制肿瘤生长，伴随FOXM1、EGFR和p-EGFR表达下降以及NEDD4L表达上升。

FOXM1高表达与NEDD4L低表达相关且预示不良预后

临床样本分析显示，在LUAD组织(包括EGFR突变型)中，FOXM1表达上调而NEDD4L表达下调。组织微阵列(TMA)分析证实FOXM1与NEDD4L蛋白表达呈负相关。生存分析表明，FOXM1高表达和NEDD4L低表达均与LUAD患者总生存期缩短显著相关。

维替泊芬作为新型FOXM1抑制剂

通过虚拟筛选FDA批准药物库，研究人员发现维替泊芬可有效抑制FOXM1表达。分子对接显示维替泊芬与FOXM1DNA结合域具有高亲和力。维替泊芬以剂量依赖方式下调FOXM1，上调NEDD4L，并抑制野生型和突变型EGFR蛋白表达。FOXM1过表达可逆转维替泊芬的这些效应。体内外实验证实，维替泊芬通过抑制FOXM1激活NEDD4L介导的EGFR降解，从而抑制LUAD生长。

维替泊芬与奥希替尼联合治疗的协同效应

研究发现NEDD4L过表达或FOXM1敲低均能增强奥希替尼耐药细胞(H1975OR)对奥希替尼的敏感性。维替泊芬处理显著提高奥希替尼耐药细胞的药物敏感性，而FOXM1过表达或NEDD4L敲低可逆转此效应。在移植瘤和转基因小鼠模型中，维替泊芬与奥希替尼联合治疗相比单药表现出显著的协同抗肿瘤效应，有效抑制肿瘤生长并降低p-EGFR和Ki67表达。

本研究系统阐明了FOXM1/NEDD4L轴在调控EGFR蛋白稳定性和LUAD进展中的关键作用。研究发现NEDD4L作为新型EGFR E3泛素连接酶，能促进野生型和多种奥希替尼敏感/耐药EGFR突变体的泛素化降解。FOXM1被鉴定为NEDD4L的上游转录抑制因子，通过抑制NEDD4L表达增强EGFR蛋白稳定性，从而促进肿瘤生长和奥希替尼耐药。

研究的创新性在于首次发现FDA批准药物维替泊芬可作为FOXM1抑制剂，通过激活NEDD4L介导的EGFR降解通路，有效抑制LUAD生长并克服奥希替尼耐药。尤为重要的是，维替泊芬与奥希替尼的联合治疗在奥希替尼耐药和初治 setting 中均显示出协同抗肿瘤效应，为EGFR突变型LUAD的治疗提供了具有临床转化潜力的新策略。

该研究不仅深化了对EGFR蛋白稳定性调控机制的理解，而且为克服EGFR-TKI耐药提供了新的治疗思路和药物选择，具有重要的理论意义和临床价值。