BRAF/MEK抑制剂双重耐药黑色素瘤细胞的表型转换与侵袭性增强机制研究

《Cell Communication and Signaling》：Phenotype switching in highly invasive resistant to vemurafenib and cobimetinib melanoma cells

本研究针对BRAF/MEK抑制剂联合治疗耐药性这一临床难题，通过对WM9和Hs294T双重耐药黑色素瘤细胞的系统性研究，揭示了耐药细胞通过表型转换获得更强侵袭能力的分子机制。研究发现耐药细胞表现出RUNX2表达上调、黏着斑形成增加、细胞铺展增强、FAK激活、细胞骨架重组、YAP/TAZ核转位、侵袭伪足增多以及蛋白酶分泌谱改变等特征，为克服靶向治疗耐药性提供了新的理论依据。

　　

黑色素瘤作为最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤，其高死亡率主要归因于快速转移特性。约50%的黑色素瘤患者携带BRAF基因突变，其中V600E突变最为常见，导致MAPK信号通路持续激活，进而促进肿瘤细胞增殖和迁移。BRAF抑制剂（如vemurafenib）与MEK抑制剂（如cobimetinib）的联合应用已成为BRAF突变型晚期黑色素瘤的标准治疗方案，然而临床实践中迅速出现的耐药性严重限制了治疗效果。

耐药性的产生机制复杂多样，包括MAPK通路再激活、BRAF V600E扩增、NRAS突变等多种因素，但其中涉及的具体分子机制尚未完全阐明。特别值得注意的是，肿瘤细胞侵袭能力的增强与转移过程密切相关，是导致患者死亡的主要原因。因此，深入探究耐药黑色素瘤细胞的侵袭特性及其调控机制，对于开发新型治疗策略具有重要意义。

本研究团队前期已成功构建了对vemurafenib和cobimetinib双重耐药的WM9和Hs294T黑色素瘤细胞系，并发现这些细胞表现出癌症干细胞特性、上皮-间质转化（EMT）特征以及多种信号通路异常激活。在此基础上，本研究进一步聚焦于耐药细胞的侵袭表型，系统分析了其迁移、黏附、细胞骨架重组和蛋白水解能力等方面的变化。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究：通过划痕实验评估细胞迁移和侵袭能力；利用蛋白质印迹法检测RUNX2、α-parvin、vinculin、FAK/pFAK等蛋白表达；采用共聚焦显微镜分析黏着斑参数、actin聚合比例、YAP/TAZ定位等；通过人类蛋白酶阵列和明胶酶谱法分析蛋白酶分泌谱；使用细胞黏附实验和MMP14活性测定评估细胞功能特性。

迁移和侵袭能力增强

划痕实验结果显示，在2D和3D条件下，耐药黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力均显著高于对照组。在Matrigel模拟的细胞外基质环境中，耐药细胞能在24小时（迁移）或48小时（侵袭）内几乎完全闭合划痕区域，而对照组细胞仅能部分闭合。此外，耐药细胞在撤药数周后仍保持这种增强的侵袭特性，表明表型改变具有稳定性。Western blot分析发现耐药细胞中RUNX2蛋白水平显著升高，这可能通过调控生长因子受体表达促进侵袭过程。

黏附特性改变

细胞形态学观察发现，耐药细胞呈现更加伸展的纺锤形形态。通过α-parvin免疫荧光染色显示，耐药细胞形成的黏着斑数量更多、面积更大、长度更长。细胞黏附实验证实耐药细胞的黏附能力约为对照组的5倍。分子水平上，Western blot检测到耐药细胞中α-parvin、vinculin蛋白水平升高，FAK磷酸化水平增加，表明黏着斑相关信号通路异常激活。

细胞骨架重组

细胞骨架分析显示，耐药细胞的F-actin/G-actin比值显著升高，表明actin聚合程度增加。免疫荧光染色观察到耐药细胞形成更多、更长、更粗的应力纤维。值得注意的是，转录共激活因子YAP/TAZ在耐药细胞中主要定位于细胞核，而在对照组中则分布于整个细胞质，提示Hippo信号通路异常。此外，研究发现β-actin和γ-actin两种亚型在耐药细胞中表达均上调，且相似地分布于各种细胞骨架结构中。

侵袭伪足形成和蛋白酶活性增强

通过cortactin和F-actin共染色发现，耐药细胞形成的侵袭伪足数量显著多于对照组。蛋白酶阵列分析显示，耐药细胞分泌多种蛋白酶的能力增强，包括组织蛋白酶A、B、D、L、S以及MMP1、MMP2、MMP3、MMP9等。进一步实验证实，耐药细胞条件培养基中MMP2和MMP9蛋白水平升高，明胶酶谱显示其活性增强。同时，细胞裂解物中MMP14（MT1-MMP）活性也显著增加。基因表达分析发现，ADAM9和ADAM17基因在耐药细胞中表达上调，而蛋白酶抑制剂TIMP1表达下调，TIMP2和TIMP3表达上调，这种复杂的调控网络可能共同促进了细胞外基质的降解。

研究结论表明，vemurafenib/cobimetinib双重耐药的黑色素瘤细胞通过复杂的分子网络调控，实现了从增殖性表型向侵袭性表型的转换。这种表型转换涉及受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路再激活、FAK异常磷酸化、细胞骨架重组、YAP/TAZ核转位、RUNX2表达上调以及蛋白酶分泌谱改变等多个层次的调控。特别值得注意的是，这些变化共同构成了一个自我强化的信号网络，使得针对单一靶点的治疗策略难以有效抑制细胞侵袭。

讨论部分强调，本研究首次系统揭示了BRAF/MEK抑制剂双重耐药黑色素瘤细胞的侵袭表型特征及其分子基础。耐药细胞表现出的低增殖率与高侵袭能力并存的现象，符合"表型转换"理论，这一过程可能由EMT样变化和癌症干细胞特性共同驱动。研究发现的细胞骨架重组、YAP/TAZ激活和蛋白酶网络失调等特征，为理解靶向治疗耐药机制提供了新的视角。

然而，研究也发现针对EGFR、MET、AKT、MMPs等单一靶点的抑制剂仅能部分抑制细胞侵袭，提示耐药细胞的侵袭特性由复杂的分子网络共同调控，而非单一通路主导。这种网络化调控机制解释了临床上单靶点治疗容易失效的原因，也为开发联合治疗策略提供了理论依据。

本研究的重要意义在于全面阐释了BRAF/MEK抑制剂耐药黑色素瘤细胞的侵袭表型特征，为克服靶向治疗耐药性提供了新的潜在靶点。未来研究需要进一步探索这些分子变化之间的因果关系和调控网络，以期开发出能够有效抑制黑色素瘤转移的联合治疗策略，最终改善晚期黑色素瘤患者的预后。