机械拉伸诱导脂肪基质细胞外泌体miR-877促进2型糖尿病大鼠骨折愈合的机制研究

《Stem Cell Research & Therapy》：MiR-877, an exosomal miRNA from mechanical stretch induced adipose derived stromal cells, enhances fracture healing in nonunion rats with type 2 diabetes mellitus

本研究针对2型糖尿病骨折不愈合这一临床难题，创新性地探索了机械拉伸刺激脂肪基质细胞（ADSCs）分泌的外泌体（MS-ADSC-Exos）的治疗潜力。研究发现，适度拉伸（6%，1.0 Hz）诱导的外泌体（LMS-ADSC-Exos）富含miR-877，可通过促进成骨分化和血管生成显著加速糖尿病大鼠骨折愈合。该研究揭示了机械生物学调控外泌体miRNA内容的新机制，为开发基于外泌体的天然生物活性纳米疗法提供了新策略。

　　

在糖尿病日益流行的今天，2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM）患者骨折后出现骨不愈合或延迟愈合已成为困扰临床医生的严重并发症。糖尿病会显著改变骨代谢、骨结构和软组织愈合过程，增加骨折和感染风险，导致骨不愈合和骨折愈合延迟加剧。这不仅影响患者功能，还可能对其心理社会和经济福祉造成冲击，带来巨大的经济和精神负担。

传统的脂肪基质细胞（Adipose-derived Stromal Cells, ADSCs）移植在临床应用中受到免疫抑制、细胞去分化和肿瘤形成等问题的限制。而外泌体（exosomes）作为细胞分泌的纳米级囊泡（30-150 nm），能够携带并传递复杂的RNA和蛋白质货物，是高效细胞间通讯的基础，可完美避免这些副作用和风险。近年来，ADSCs来源的外泌体已在再生医学和组织修复重建研究中逐步取代ADSCs。

机械拉伸在间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）分化、血管形成等过程中起着至关重要的作用，这些过程对骨折愈合至关重要。细胞感知、转导和传递来自周围的机械信号至细胞核，诱导基因表达变化，进一步影响参与骨愈合的受体细胞的生物学行为。外泌体来源于各种细胞类型，其特性与来源细胞相似。因此，探索不同强度机械应力（循环拉伸应力）下ADSCs来源的外泌体对骨髓间充质基质细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells, BMSCs）成骨分化的影响，并证明应力诱导的ADSCs来源的外泌体通过上调microRNA-877促进大鼠骨折愈合，具有重要的科学意义和临床价值。

为了回答这些问题，田亮、张东等研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了他们的最新研究成果。他们首次研究了机械拉伸诱导的脂肪基质细胞外泌体（MS-ADSC-Exos）是否增强2型糖尿病非愈合模型中的骨折愈合，并阐明了其潜在机制。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过高脂饮食（High-Fat Diet, HFD）和链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）诱导建立T2DM大鼠模型，并建立股骨横向骨折不愈合模型；使用细胞张力培养系统对ADSCs施加不同幅度（0%、6%、18%）的循环机械拉伸；通过差速离心法分离外泌体，并利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticles Tracking Analysis, NTA）和Western blotting进行鉴定；通过碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）染色、茜素红S（Alizarin Red S, ARS）染色、体外成管实验、划痕实验和迁移实验评估成骨分化、增殖、迁移和血管生成；通过micro-CT和组织学分析评估体内骨再生；采用RNA测序、生物信息学分析和qRT-PCR表征MS-ADSC-Exos的miRNA谱；通过模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）转染实验验证miR-877的功能作用。

Characterization and identification of ADSC-exos

研究人员成功从大鼠腹股沟皮下脂肪中获取ADSCs，并通过流式细胞术鉴定其特异性标志物（CD44⁺CD90⁺CD34^-CD45^-）。透射电镜显示ADSC-Exos呈杯状形态，Western blot分析鉴定其特异性标志物（CD9、CD63、TSG101），纳米颗粒跟踪分析显示其尺寸分布范围为30-200 nm，平均直径约为120 nm。通过荧光显微镜观察发现，ADSC外泌体可被BMSCs内化。

Cyclic mechanical stretch-induced ADSCs-exosomes promote osteogenic differentiation of BMSC in vitro

研究发现，与PBS组相比，LMS-Exos显著促进BMSC成骨分化，而HMS-Exos显著抑制BMSC成骨。Western blotting和免疫荧光染色显示，LMS-Exos组中RUNX-2、OCN蛋白表达水平显著上调，而HMS-Exos组中表达下调，证实LMS-Exos在体外加速成骨，HMS-Exos阻碍成骨。

Cyclic mechanical stretch-induced ADSCs-exosomes promote angiogenesis in vitro

划痕伤口愈合实验、Transwell实验和成管实验结果表明，与PBS（阴性对照）相比，LMS-Exos在增强血管生成方面显示出最佳效果，而HMS-Exos显示血管生成作用受损。Western Blotting检测显示血管生成标志物VEGF和CD31表达水平变化与上述结果一致，证实适度循环机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体在体外牢固促进血管生成。

Cyclic mechanical stretch induced ADSCs-exosomes promote osteogenesis differentiation and bone healing of BMSC in non-union rats fracture model

体内实验进一步证实了局部注射循环机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体对非愈合大鼠的治疗效果。X射线、Micro-CT检查和形态学参数（骨体积/总体积，BV/TV）显示，经适度强度机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体治疗的大鼠骨折愈合加速。与高强度拉伸诱导的ADSC-外泌体治疗的大鼠和非拉伸治疗的大鼠相比，低拉伸诱导的ADSC-外泌体治疗的大鼠表现出最小的骨折间隙和更大的骨痂体积，表明骨再生和骨折愈合速度最快。而高强度拉伸组大鼠在骨再生和骨折愈合方面显示最差的结果，表明高强度循环机械拉伸外泌体损害骨再生和骨折愈合。

MiR-877 expression was upregulated in cyclic mechanical stretch-induced ADSCs-exosomes

由于外泌体miRNA在骨修复和再生中起重要作用，研究人员进一步鉴定了来自不同强度机械拉伸诱导的ADSCs的外泌体中差异表达的miRNA。通过miRNA测序分析LMS-ADSC-Exos和NMS-ADSC-Exos中miRNA的mRNA表达水平，热图和火山图分析显示，与NMS-ADSC-Exos组相比，LMS-ADSC-Exos中许多miRNA显著上调。qRT-PCR评估ADSC-MS-Exos中的miRNA，结果证实miR-877在所有六个上调miRNA中表达上调程度最大。进一步结果表明，miR-877可以从机械拉伸诱导的外泌体转移到受体细胞（BMSCs和HUVECs）中，并在受体细胞中有效表达。

Cyclic mechanical stretch-induced ADSCs-exosomes promote osteogenesis differentiation and angiogenesis to enhance bone healing via upregulating miR-877 expression in vitro.

为了证实miR-877对体外成骨分化和血管生成的影响，通过慢病毒载体转染引入外源性合成miRNA-877。qRT-PCR结果显示，miR-877-模拟物（mimic）增加了BMSCs中miR-877的水平，而miR-877-抑制剂（inhibitor）显著降低了BMSCs中miR-877的水平。Western blotting显示，miR-877-模拟物组中这些成骨相关基因的表达显著增加，而miR-877-抑制剂组中表达降低。茜素红和ALP染色显示，miR-877过表达后矿化显著增加，而miR-877抑制后矿化减少。同样，成管形成实验显示，miR-877过表达后血管生成作用显著增强，而miR-877抑制后血管生成作用明显降低。总之，循环机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体通过上调miR-877表达在体外促进成骨分化和血管生成以增强骨愈合。

研究结论和讨论部分强调，外泌体作为多路信号平台能够传输包含复杂自分泌和旁分泌信号的丰富货物分子。这种细胞间囊泡运输途径在人类健康和疾病的许多方面发挥关键调节作用。基于这些特性，外泌体正在被开发为多种疾病模型中的新型治疗剂。

机械刺激是骨发育、再生和骨折愈合的关键因素。当受到机械刺激时，成骨细胞显示出许多与骨折愈合相关的细胞反应。本研究研究了不同幅度单向拉伸的影响，检测了不同幅度循环机械应变下，循环机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体对BMSC的影响。结果揭示了BMSC以幅度依赖性方式响应来自机械应力处理的ADSC的外泌体。

为了阐明BMSC对类似于骨再生和骨折愈合过程中发生的机械应变反应的分子机制，研究人员在体外拉伸ADSCs以获得机械拉伸诱导的外泌体。考虑到miRNA是外泌体中包含的关键生物活性分子，研究人员提取了来自不同强度机械拉伸诱导的ADSC-MS-Exos分泌的外泌体，然后通过RNA测序、生物信息学分析和qRT-PCR评估miRNA。结果表明miR-877是显著上调的miRNA。此外，用miR-877模拟物和抑制剂转染BMSCs和HUVECs表明，miR-877在体外和体内促进骨再生和骨折愈合。

然而，骨折愈合和骨再生是复杂的生物学过程，涉及许多特殊细胞及其分泌物质、生物活性分子在不同阶段的作用。此外，目前的研究已经证实，不同形式和强度的机械刺激可能直接或间接调节这些过程，导致不同甚至矛盾的结论。因此，机械因素转导和调控途径可能是复杂的交互串扰，尚未完全理解。

该研究提出了一个新的发现，即移植LMS-ADSC-Exos通过促进成骨和血管生成 via miR-877在糖尿病大鼠中发挥加速骨再生和骨折愈合的作用。然而，研究中存在一些局限性。首先，是否存在任何上游信号通路，如通常作为ceRNA和miRNA分子海绵的circRNA，涉及机械刺激诱导的外泌体miRNA-877，尚未在本研究中调查。其次，LMS-ADSC-Exos通过miR-877促进成骨和血管生成发挥加速骨再生和骨折愈合作用的明确和详细的下游机制尚未分别揭示。第三，虽然研究结果在糖尿病大鼠模型中有望，但骨生物学中的种间差异可能限制直接的临床推断。此外，机械刺激的ADSC外泌体的大规模生产、标准化和质量控制对治疗应用构成实际障碍。

总之，该研究表明，来自机械拉伸诱导的ADSC的外泌体miR-877可通过促进成骨分化和血管生成加速T2DM糖尿病大鼠的骨再生和骨折愈合。这一发现为骨再生和骨折愈合的分子机制提供了新的见解，并为开发基于外泌体的新治疗策略用于糖尿病非愈合患者提供了新思路。