基于碱基编辑和正负筛选标记的柑橘与杨树无转基因基因组编辑技术研究

《Plant Cell Reports》：Transgene-free genome editing in citrus and poplar trees using positive and negative selection markers

本研究针对多年生木本植物难以获得无转基因基因组编辑植株的难题，开发了一种基于高效胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的正负筛选策略。研究人员通过农杆菌瞬时表达系统，同时编辑ALS基因(赋予除草剂抗性)和目的基因(CsNPR3/Pt4CL1)，结合FCY-UPP毒素系统进行负向筛选，在柑橘和杨树中成功获得了无转基因的共编辑植株，为多年生植物的基因功能研究和育种应用提供了新技术路径。

　　

在植物生物技术领域，CRISPR-Cas基因组编辑技术已经展现出巨大的应用潜力。然而，当通过农杆菌介导的转化方法进行操作时，第一代基因组编辑植物几乎总是转基因植株。对于遗传分析和育种应用而言，无转基因的基因组编辑植物具有重要价值，不仅能简化监管审批流程，还能提高消费者接受度。

这一挑战在无性繁殖或多年生植物中尤为突出，例如柑橘和杨树。这些作物生命周期长，育种系统复杂（杨树甚至为雌雄异株），使得通过传统杂交分离转基因的同时获得纯合编辑变得几乎不可能。因此，开发能够在T0代获得无转基因编辑植株的技术策略，对于这些作物的遗传改良具有重要意义。

目前已有多种策略尝试解决这一难题，包括向原生质体直接递送核糖核蛋白(RNPs)、促进转基因自消除或使用植物病毒载体进行瞬时表达。然而，这些方法存在局限性，如许多物种和基因型难以从原生质体再生、缺乏体外选择系统以及高嵌合体率等。农杆菌介导的T-DNA递送是作物中最常用且便捷的方法，但其通常导致转基因稳定整合。利用农杆菌进行瞬时表达为获得无转基因编辑植株提供了可能，但需要建立不依赖传统抗生素筛选的新策略，以确保高效选择编辑事件的同时避免转基因整合。

在这一背景下，发表在《Plant Cell Reports》的研究论文"Transgene-free genome editing in citrus and poplar trees using positive and negative selection markers"提出了一种创新方法。研究人员将高效的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)与正负选择标记相结合，探索在柑橘和杨树中实现无转基因基因组编辑的可行性。

为开展研究，研究人员主要应用了以下关键技术：构建了包含hA3A-Y130F胞嘧啶碱基编辑器(CBE)、ALS基因和目的基因(CsNPR3/Pt4CL1)sgRNA以及FCY-UPP毒素基因的T-DNA载体；通过农杆菌介导法转化柑橘上胚轴和杨树叶柄外植体；利用除草剂氯磺隆进行正向选择筛选ALS基因编辑细胞；使用5-氟胞苷(5-FC)进行负向选择消除转基因植株；通过PCR检测转基因整合情况；采用高通量测序(NGS)和桑格测序分析编辑效率与基因型。

阳性筛选与除草剂抗性

研究设计了针对柑橘CsALS基因两个等位基因的特异性sgRNA，以及针对CsNPR3基因的sgRNA，旨在通过CBE引入提前终止密码子实现基因敲除。构建了含或不含TLS2移动RNA模体的多重CBE载体。

结果表明，不含TLS2的载体(pLR5432)产生了更多除草剂抗性植株，其中51株显示CsALS基因编辑，47株同时显示CsNPR3基因编辑，共编辑效率高。而含TLS2的载体(pLR5433)仅22株（约30%）显示CsALS编辑，无CsNPR3编辑植株，表明TLS2可能降低编辑效率。早期除草剂处理（共培养后7天）可显著减少逃逸植株，编辑效率超过90%。

阴性筛选与基因组编辑特征

在应用5-FC底物进行阴性筛选前，通过PCR检测鉴定转基因植株。从pLR5432转化中获得24株无转基因且双基因编辑植株，占再生植株的23.75%。所有编辑植株均成功实现CsALS基因的C-to-T编辑（脯氨酸变为苯丙氨酸）和CsNPR3基因的终止密码子引入。

根据编辑读段百分比，将植株分为嵌合型（0-30%）、单等位基因型（>30-70%）和双等位基因型（>70%）。大多数再生植株呈嵌合型，这在柑橘中常见。所有单等位基因和双等位基因编辑植株均为转基因阳性，表明T-DNA整合与表达可提高编辑效率。

5-FC筛选实验显示，0.25 g/L浓度对柑橘芽苗无显著影响，0.5 g/L开始影响转基因植株，1 g/L时连对照植株也出现受害症状。这表明5-FC作为阴性选择标记的可靠性有限，优化浓度和应用时机可能提高效率。

杨树中的高效编辑

在杨树中，研究靶向Pt4CL1和PtALS基因进行共编辑。所有再生植株均在PtALS位点编辑，无除草剂逃逸。pLR5478载体（无TLS2）的共编辑效率为80.95%，pLR5479载体（含TLS2）为92.22%。

转基因检测显示127株为转基因植株。5-FC处理7天后，约半数转基因植株出现坏死症状，但14天后所有植株均受害，表明杨树对5-FC更敏感。最终，pLR5478载体获得15株无转基因共编辑植株（效率32.5%），而含TLS2载体仅4株（4.86%）。

基因型分析显示，杨树中单等位基因和双等位基因编辑比例较高。桑格测序证实了无转基因株系中的编辑事件，例如株系30在Pt4CL1位点为纯合编辑，表明成功获得目的基因功能缺失突变体。

讨论与意义

本研究成功建立了在T0代获得无转基因编辑柑橘和杨树的技术体系。与以往研究相比，该方法的共编辑效率显著提高（柑橘23.75%，杨树32.45%），这主要归因于高效hA3A-Y130F碱基编辑系统的使用和优化后的筛选策略。

研究首次在柑橘中验证了单纯依靠碱基编辑实现共编辑的可行性。与原生质体RNP方法相比，该技术更简单实用，避免了原生质体再生难题。然而，编辑嵌合体现象仍然普遍，尤其在柑橘中更为明显，这提示需要进一步优化编辑效率。

意外的是，TLS2移动RNA序列的添加降低了编辑效率，可能与RNA稳定性有关，这一发现对移动RNA在植物基因组编辑中的应用提出了新问题。

FCY-UPP负筛选系统在柑橘和杨树中表现出一定效果，但存在逃逸现象和物种特异性差异。优化5-FC浓度和应用时机可能提高筛选可靠性。

该研究为多年生木本植物的基因组编辑提供了实用技术方案，对作物遗传改良和育种应用具有重要意义。未来可探索更多高效碱基编辑器、优化sgRNA表达策略，以及开发更可靠的负筛选系统，进一步提高无转基因编辑的效率和应用范围。