血液肿瘤突变负荷作为不可切除非小细胞肺癌放化疗联合度伐利尤单抗治疗生物标志物的研究

《Frontiers in Oncology》：Blood-based tumor mutational burden as a biomarker in unresectable non-small cell lung cancer treated with chemoradiotherapy and durvalumab

本文前瞻性探索了血液肿瘤突变负荷（bTMB）在不可切除III期非小细胞肺癌（NSCLC）同步放化疗（CRT）后度伐利尤单抗巩固治疗中的预测价值。研究发现高bTMB（cut-off=6.6/8.5 mut/Mb）、PD-L1≥1%与更长无进展生存期（PFS）相关，而ctDNA检测的STK11/KEAP1/NFE2L2突变提示不良预后。研究支持多生物标志物整合策略可优化III期NSCLC风险分层治疗决策。

　　

引言

约20-30%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者在诊断时已处于III期。对于不可切除的III期NSCLC患者，体能状态良好者可接受根治性放疗（60-66 Gy）联合铂类双药化疗。PACIFIC试验及真实世界数据表明，放化疗（CRT）后巩固使用一年抗程序性死亡配体1（PD-L1）抑制剂度伐利尤单抗可显著改善预后。然而，尽管接受度伐利尤单抗治疗，许多患者仍出现疾病复发，而未接受度伐利尤单抗治疗的患者中高达20%可实现长期无病生存。这些观察结果凸显了对新生物标志物的需求，以更好地预测治疗反应并实现个性化、风险适应性治疗。

目前，PD-L1表达是预测NSCLC免疫检查点抑制剂（ICIs）疗效最具临床实用性但仍不完美的生物标志物。肿瘤突变负荷（TMB），定义为肿瘤基因组编码区每兆碱基中体细胞非同义突变的数量，已成为另一个有前景的生物标志物。理论上，高TMB可能增加肿瘤新抗原形成，从而增强新抗原特异性T细胞反应，提高对ICIs的敏感性。虽然TMB最初通过全外显子组测序（WES）在肿瘤组织样本中进行分析，但越来越多的证据表明，只要检测panel足够大（≥1 Mb），靶向基因panel可提供相当的精确度。近年来，出现了在循环肿瘤DNA（ctDNA）中测定TMB的方法。基于血液的TMB（bTMB）分析侵入性更小，并且在难以获取肿瘤组织的情况下是唯一可行的选择。此外，bTMB可能不易受肿瘤异质性的影响，并允许在治疗期间进行重复评估。然而，液体与组织基于TMB分析的一致性以及最佳方法仍有待确定。

在晚期NSCLC中，研究表明高TMB与从ICIs中获得更大益处相关，尤其是当免疫疗法单独使用而非与化疗联合时。此外，在此背景下，TMB似乎独立于PD-L1表达。在早期可切除的NSCLC中，有报道称高组织TMB（tTMB）可预测术后放疗后改善的局部区域控制，表明TMB可能作为放射敏感性的生物标志物。然而，TMB在局部晚期NSCLC接受放化疗和度伐利尤单抗治疗中的作用仍未得到充分探索。

检测特定突变为检查NSCLC的突变景观以寻找预后和预测性生物标志物提供了另一种方法。STK11突变损害DNA损伤修复，而KEAP1/NFE2L2突变增强癌细胞耐受氧化应激的能力，这两者都有助于放射抵抗。此外，STK11、KEAP1和NFE2L2的改变与免疫学上的"冷"肿瘤微环境相关，可能作为免疫治疗的阴性预测生物标志物。

度伐利尤单抗放化疗后（DART）研究纳入了符合CRT后接受度伐利尤单抗治疗的不可切除III期NSCLC患者。目的是探索治疗反应和抵抗背后的生物学机制。本文评估了TMB、PD-L1表达和基于ctDNA的致病基因改变作为该背景下的生物标志物，主要关注bTMB与无进展生存期（PFS）之间的关联。

材料与方法

DART研究是一项在挪威、芬兰、立陶宛和爱沙尼亚的十家医院进行的多中心II期转化和生物标志物研究。入组不可切除的III期NSCLC患者，接受根治性放化疗，包括每三周一次铂类双药化疗两个周期，以及每次2 Gy、总剂量60-66 Gy的放疗。CRT后无疾病进展的患者接受度伐利尤单抗1500 mg每四周一次，最好在CRT完成后五周内开始，并持续至进展、不可耐受的毒性或最长12个月。未开始使用度伐利尤单抗的参与者被排除在分析之外。

研究遵循《赫尔辛基宣言》、良好临床实践以及所有适用法律和机构指南。获得了区域医学和健康研究伦理委员会的批准。所有参与者均提供了知情同意。试验在ClinicalTrials.gov注册（NCT04392505）。

基线影像学检查包括胸部/上腹部CT、脑部MRI或CT以及全身18F-FDG PET/CT。在CRT完成后至首次度伐利尤单抗输注期间、度伐利尤单抗治疗期间每12周、以及随后两年内通过CT进行肿瘤评估，之后三年内每26周评估一次，直至进展或死亡。如有临床指征，进行补充MRI和PET/CT检查。肿瘤反应根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版进行评估。作为CRT一部分接受放疗的病灶被视为可测量病灶。疾病进展需要RECIST 1.1的影像学进展，并得到以下一项支持：1）显示明确进展的活检或PET，2）临床恶化，或3）在初始扫描后至少四周进行的确认性CT扫描。如果进展得到确认，则记录首次提示进展的扫描日期。主要终点是PFS，定义为从度伐利尤单抗开始到疾病进展或任何原因死亡的时间。总生存期（OS）从度伐利尤单抗开始计算至死亡。

在基线时获取福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织和匹配的血沉棕黄层样本用于种系变异过滤。由病理学家审查HE染色的FFPE切片以确认肿瘤含量。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit（Qiagen）提取肿瘤DNA，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）提取血沉棕黄层DNA。使用Qubit、Nanodrop和Genomic DNA ScreenTape评估DNA浓度和质量。肿瘤DNA浓度 > 3 ng/μl且具有匹配血沉棕黄层的样本提交进行测序。WES在OUH基因组学核心设施使用Twist Biosciences Library Preparation Kit和Twist Human Comprehensive Exome Enrichment Kit（Illumina）进行。在NovaSeq6000系统上进行测序（2 × 150 bp），平均覆盖度为150×（肿瘤）和50×（血沉棕黄层）。使用Burrows–Wheeler Aligner（BWA_MEM2）将测序读数比对到人类参考基因组GRCh38。使用GATK Mutect2和Strelka识别体细胞变异，并使用Personal Cancer Genome Reporter进行注释。变异等位基因频率（VAF）≥ 5%且肿瘤读取深度≥ 100×的变异被纳入tTMB计算，tTMB定义为目标外显子组每兆碱基中非同义单核苷酸变异（SNV）和插入缺失（indel）的数量。

基线时在三根10 ml cfDNA BCT管（Streck）中收集外周血。在-80°C储存前，通过两步离心分离血浆。使用Mag-Bind cfDNA Kit（Omega Bio Tek）从8 ml血浆中提取cfDNA，在自动化平台（Opentrons OT-2, KingFisher Flex）上进行。DNA文库构建遵循既定方案，包括dA加尾、接头连接和索引PCR，中间使用Agilent 4150 TapeStation进行质量控制。通过杂交使用TACS（靶标捕获序列）捕获目标区域。使用NeoThetis Pan Cancer Plus assay（MEDICOVER Genetics），靶向222个癌症相关基因，总计1.25 Mb，以识别单核苷酸变异（SNV）、小插入缺失（indel）、拷贝数扩增（CNA）和结构重排。捕获的文库在NovaSeq6000平台（Illumina）上进行测序。使用bcl-convert进行读数解复用，在比对到GRCh37之前去除低质量读数和接头序列。通过独特的接头家族对重复读数进行分组，生成一致性读数。为了进一步细化阳性变异调用集，应用了统计误差校正模型（在碱基对分辨率），然后是过滤生物信息学流程。ctDNA变异调用是从头进行的（非肿瘤引导），变异根据AMP指南使用自动分级（VarSomeClinical）进行分类，随后由至少两名变异分析师进行人工审查。如果变异VAF < 0.25%、人群频率 > 1%（gnomAD）、是同义的或被认为是低置信度的，则被排除。对于bTMB计算，仅计数覆盖度≥ 1000×的目标区域中的SNV和indel。

使用Kaplan-Meier法估计PFS和OS。使用反向Kaplan-Meier计算随访时间。TMB作为分类变量（低 vs. 高）使用几个截断值进行分析，包括8.5 mut/Mb（方案预设的主要截断值）和队列中位数。8.5 mut/Mb的截断值是在201年方案规划时设定的，参考了转移性NSCLC的中位数（7-10 mut/Mb）以及当时普遍使用的10 mut/Mb。鉴于III期NSCLC数据有限且预期TMB略低，选择8.5 mut/Mb以平衡生物学合理性和统计功效。STK11、KEAP1和NFE2L2突变作为一个分组变量进行分析，反映了与治疗抵抗相关的共同生物学特性以及这些改变的个体频率较低。使用Fisher精确检验或卡方检验评估基线患者特征与基因组变量之间的关联。对于分类变量与连续变量，应用Wilcoxon秩和检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（两组以上）。使用Spearman方法检查相关性。使用对数秩检验和Cox比例风险模型评估临床/基因组特征与PFS之间的关联。在单变量分析中与结局显著相关的关键变量，在调整了年龄和体能状态（已确定的预后因素）的多变量Cox回归模型中进行进一步评估。如研究方案预设，显著性阈值（α）设定为0.10，使用单侧p值检验预期方向的效应。使用R（v4.1.1）进行统计分析。

结果

临床和治疗特征

在2020年5月5日至2023年9月7日期间，筛查了123名患者，其中90名符合所有资格标准并完成了CRT。其中87名开始了度伐利尤单抗治疗。一名患者在重新检查肺部肿瘤活检后被排除，结论是直肠癌转移。另一名患者在随后的影像学审查中发现为IIB期疾病，但被纳入主要分析，因为该患者患有不可切除的NSCLC并按方案治疗。86名患者的基线临床特征如表1所示。中位年龄为69岁（范围36-85），60%为男性，95%有吸烟史。组织学上，57%的肿瘤为鳞状细胞癌，41%的PD-L1表达 <1%。从CRT结束到度伐利尤单抗开始的中位时间为24天（范围6-45），中位度伐利尤单抗输注次数为11次（范围1-13）。

基因组特征

86名患者中有81名获得了基线血浆样本用于测序，全部通过质量控制。中位bTMB为6.6 mut/Mb（范围：0–41.9 mut/Mb）。使用预设的8.5 mut/Mb截断值，49名患者被归类为bTMB低，32名为bTMB高。未发现bTMB与基线患者特征之间存在显著关联。oncoprint图总结了在血浆ctDNA中检测到的功能相关基因组改变。TP53是血浆中最常改变的基因（68%的患者），其次是KRAS（17%）。21%的患者观察到STK11、KEAP1或NFE2L2的改变。血浆ctDNA中存在TP53突变的患者bTMB更高。其他个体突变与bTMB无显著关联，但合并的STK11/KEAP1/NFE2L2改变与较高的bTMB和PD-L1阴性相关。

在81名有测序血浆样本的患者中，36名患者的肿瘤组织具有足够的肿瘤含量进行WES。中位tTMB为11.6 mut/Mb（范围：2.6–49.5 mut/Mb）。bTMB与tTMB之间的相关性为中等（Spearman’s ρ = 0.50），tTMB值显著更高。使用中位数将TMB分类为高或低时，75%的患者通过bTMB和tTMB被一致分类。bTMB和tTMB均与PD-L1表达无显著相关性，尽管在PD-L1 ≥ 1%的患者中观察到bTMB较高的微弱趋势。在匹配的血浆和组织样本中（基因水平存在/缺失比较），关键基因中60%的突变（SNV和indel）在血浆和肿瘤组织中均被检测到，25%仅存在于肿瘤中，15%仅存在于血浆中。

临床结局

截至截止日期（2024年12月1日），中位随访时间为33.1个月。中位PFS为18.9个月。共有47名患者经历了进展事件，中位时间为8.3个月。其中20例为局部复发，19例为远处转移，2例同时有局部复发和远处转移，6例死亡但无记录进展。中位OS未达到。12个月和24个月OS率分别为87.2%和71.5%。在基线临床特征与PFS的单变量分析中，年龄≥75岁和男性与较短的PFS相关。吸烟状况、ECOG体能状态、疾病分期、组织学或从CRT到度伐利尤单抗的时间与PFS无显著关联。

TMB与PFS的关联

使用预设的8.5 mut/Mb截断值，高bTMB患者比低bTMB患者PFS改善（HR: 0.65）。高bTMB组中位PFS未达到，低bTMB组为16.7个月。应用中位数6.6 mut/Mb作为替代截断值，高bTMB与更长的PFS显著相关（HR: 0.52）。高bTMB组中位PFS未达到，低bTMB组为14.8个月。更高的阈值（10、16和20 mut/Mb）未产生与PFS的显著关联，可能是因为分类为高bTMB的患者数量很少。

排除具有STK11/KEAP1/NFE2L2突变的患者后，高bTMB与更长PFS的关联对于8.5 mut/Mb截断值和6.6 mut/Mb截断值均得到加强。10 mut/Mb截断值也达到显著性。

在36名具有tTMB数据的患者中，高和低tTMB组之间未观察到显著的PFS差异。

PD-L1表达与PFS的关联

肿瘤PD-L1表达≥ 1%的患者比PD-L1 < 1%的患者PFS改善（HR: 0.38）。结合bTMB和PD-L1状态，使用8.5 mut/Mb或6.6 mut/Mb截断值，均观察到同时具有PD-L1 ≥ 1%和高bTMB的患者PFS最长。与参考组（PD-L1 < 1%且低bTMB）相比，PD-L1 ≥ 1%且bTMB ≥ 8.5 mut/Mb的患者进展或死亡风险显著降低。使用6.6 mut/Mb截断值时关联更强。

血液中基因组改变与PFS的关联

在单变量分析中，血浆中存在STK11、KEAP1或NFE2L2突变与较短的PFS相关（HR 1.84）。具有≥1个这些突变的患者中位PFS为5.7个月，而野生型患者为19.6个月。将STK11/KEAP1/NFE2L2状态与bTMB结合，确定了一个特别有利的队列：STK11/KEAP1/NFE2L2野生型且高bTMB（>8.5 mut/Mb）的患者与具有STK11/KEAP1/NFE2L2改变和低bTMB的患者相比，HR为0.37。其他在≥10名患者中存在的ctDNA检测改变的PFS关联见图S6。KRAS突变与更长的PFS相关。在排除具有STK11或KEAP1共突变的患者后，KRAS突变患者的预后进一步改善。

与PFS相关的多变量分析

由于高bTMB在使用预设的8.5 mut/Mb截断值和中位数6.6 mut/Mb的单变量分析中均与更长的PFS相关，我们对这些截断值进行了单独的多变量分析。在8.5 mut/Mb模型中，只有PD-L1表达≥ 1%与更长的PFS显著相关，而STK11/KEAP1/NFE2L2突变显示出较短的PFS趋势。在6.6 mut/Mb模型中，高bTMB、PD-L1 ≥ 1%和STK11/KEAP1/NFE2L2突变均与PFS显著相关，高bTMB和PD-L1 ≥ 1%与更长的PFS相关，STK11/KEAP1/NFE2L2突变与较短的PFS相关。

讨论

在这项针对接受CRT和度伐利尤单抗治疗的不可切除III期NSCLC患者的前瞻性队列研究中，高bTMB和PD-L1 ≥ 1%与更长的PFS相关，而ctDNA检测到的STK11、KEAP1或NFE2L2突变与较短的PFS相关。这些发现为了解治疗反应和抵抗提供了见解，并揭示了指导局部晚期NSCLC临床决策的潜在生物标志物。

虽然TMB是IV期NSCLC免疫治疗益处的已知预测因子，但其在接受多模式治疗的局部晚期疾病中的作用仍不太明确。最近，回顾性分析报告高tTMB与CRT和度伐利尤单抗巩固治疗后更长的疾病控制相关。然而，在局部晚期NSCLC中，获取足够的肿瘤组织进行常规诊断可能具有挑战性，通常留下的材料不足以进行tTMB和其他生物标志物分析。在本试验中，81名患者中只有36名拥有基线肿瘤组织样本且肿瘤含量足够进行tTMB测定。基于ctDNA的基因组分析和bTMB评估在组织有限时提供了一种实用的替代方案，具有几个优势：侵入性更小、不易受肿瘤内和肿瘤间异质性的影响，并且更易于在整个治疗过程中进行重复测量以进行动态bTMB监测。

TMB可能通过多种机制影响对CRT和度伐利尤单抗的反应。高TMB是免疫治疗益处的预测因子。虽然当免疫疗法与化疗联合时，其预测价值似乎减弱，但这可能不适用于与放疗联合的情况。高TMB肿瘤提供更具免疫原性的肿瘤微环境，具有更多的肿瘤新抗原和增加的CD8阳性和PD-1阳性T细胞浸润，这可能增加肿瘤细胞对放疗免疫相关效应的易感性。此外，高TMB与DNA损伤反应和修复（DDR）基因的改变相关，这些基因在放射修复中起关键作用。理论上，这些基因的致病性突变可能进一步增加放射敏感性。

目前对于定义高与低TMB的最佳阈值尚未达成共识。在本研究中，6.6 mut/Mb（中位数）和方案预设的8.5 mut/Mb截断值在单变量分析中均与PFS显著相关。然而，仅当使用6.6 mut/Mb截断值时，该关联在多变量分析中仍然显著。应用更高的截断值未产生高bTMB与更长PFS的显著关联，可能是由于分类为高bTMB的患者数量少且统计功效有限。虽然FDA批准帕博利珠单抗用于高TMB实体瘤使用了10 mut/Mb的截断值，但一些试验建议使用更高的阈值（第80-90百分位数）以更好地预测免疫疗法疗效。相反，Meng等人的一项荟萃分析表明，较低的截断值可能更有效地识别可能从免疫治疗中获益的患者。最终，最佳阈值可能取决于肿瘤类型、疾病分期、方法和检测方法，因此难以定义通用标准。

与PACIFIC和PACIFIC-R研究的结果一致，我们发现肿瘤PD-L1表达≥ 1%的患者在CRT和度伐利尤单抗后比PD-L1阴性患者有更好的PFS。在我们的队列中，PD-L1作为二分变量（截断值为1%）是与PFS关联最强的生物标志物，无论是在单变量还是多变量分析中，加强了其在该背景下的临床相关性。然而，一些将PD-L1表达分为多个水平的试验报告了PD-L1阴性和PD-L1低表达（1-49%）疾病的相似结局，表明PD-L1可能更适合作为连续变量并与其他生物标志物结合评估。我们的数据支持bTMB和PD-L1作为独立标志物，同时具有高bTMB和PD-L1 ≥ 1%的患者观察到最长的PFS。虽然是探索性的而非改变实践，但这些结果支持整合PD-L1、TMB和额外肿瘤特征的多生物标志物方法，以优化该患者群体的预后和指导治疗选择。

我们的数据表明，通过ctDNA分析检测到的STK11、KEAP1和NFE2L2致病性突变与接受CRT和度伐利尤单抗治疗的患者较差的PFS相关。这些突变与增加的放射抵抗有关。越来越多的证据也支持具有STK11或KEAP1突变的肿瘤对化疗和PD-L1靶向免疫治疗的反应较差，表明它们作为阴性预后生物标志物的作用。如果我们的发现和六个月的中位PFS反映了该亚组CRT和度伐利尤单抗的预期益处，则可能需要风险适应性策略。来自POSEIDON和CheckMate 227的亚组分析表明，添加CTLA-4抑制剂可能改善具有STK11和KEAP1突变的转移性NSCLC的结局。然而，考虑到CRT和度伐利尤单抗的联合治疗已经很强，为了微小的结局改善而进一步强化治疗应谨慎考虑。针对STK11和KEAP1/NRF2通路的新疗法正在研究中，未来可能发挥作用。重要的是，并非所有STK11/KEAP1/NFE2L2突变都具有同等的危害性。突变亚型、克隆性、更广泛的基因组景观和共突变（特别是KRAS）在评估这些改变的临床影响时应考虑在内。

虽然高bTMB与更长的PFS相关，但我们的多变量分析表明，它作为不可切除局部晚期NSCLC的独立生物标志物可能不够稳健。将bTMB与额外的分子标志物（如致病基因改变）相结合，可以更好地捕捉肿瘤的分子特征并改善结局预测。在我们的试验中，三名bTMB > 20 mut/Mb的患者在12个月内经历了疾病进展，所有这些患者都携带STK11、KEAP1或NFE2L2的有害突变。此外，当排除具有这些突变的患者后，高bTMB与更长PFS的关联得到加强。Shaverdian等人报告了类似的发现，高tTMB预测术后放疗后改善的局部区域控制，主要是在没有与放射抵抗相关基因突变的NSCLC患者中。在我们的研究中，高bTMB和STK11/KEAP1/NFE2L2野生型状态的组合确定了一个预后特别好的亚组。如果在未来的试验中得到验证，该队列可考虑进行治疗降级，例如缩短度伐利尤单抗治疗持续时间。

组合策略不仅可以纳入bTMB、PD-L1状态和关键基因的致病性突变，还可能纳入细胞因子、免疫细胞组成和肿瘤微环境特征等因素。多生物标志物模型可能为个性化治疗提供更坚实的基础。然而，要使这种方法在临床上适用，它必须实用、省时且具有成本效益。最重要的是，在将这些生物标志物指导的策略纳入常规临床实践之前，需要进一步的前瞻性验证。

本研究的一些局限性应予承认。其探索性性质体现在某些遗传亚组的规模小以及使用0.10的显著性水平。生存数据仍不成熟，生物标志物相关亚组之间的PFS差异是否会转化为OS差异仍有待观察。由于所有患者接受相同的治疗，也很难确定所研究的生物标志物是预测性的还是仅仅是预后性的。对于bTMB与tTMB的比较，以及血浆与组织基于的突变检测，使用了不同的检测方法（靶向panel vs. WES）和参考基因组（GRCh37 vs. GRCh38），这限制了在没有转换/重新验证的情况下进行严格的变异水平匹配。因此，除了生物学原因外，可能还有几个技术原因导致先前报告的中等一致性。最后，只有36名患者拥有基线组织样本且肿瘤含量足够进行测序，并且在某些情况下，DNA浓度低于推荐阈值（10 ng/μl），增加了tTMB结果的不确定性。

总之，高bTMB和PD-L1表达≥ 1%与接受CRT和度伐利尤单抗巩固治疗的III期NSCLC患者更长的PFS相关，而ctDNA检测到的STK11、KEAP1或NFE2L2致病性突变与较短的PFS相关。需要未来的研究来验证这些作为互补生物标志物，并探索个性化治疗策略，包括风险适应的强化或降级治疗。