全基因组宏基因组学揭示印度泰米尔纳德邦城乡人为污染土壤微生物群落与耐药组的变异及其生态意义

《Frontiers in Microbiology》：Comprehensive whole metagenomics analysis uncovers microbial community and resistome variability across anthropogenically contaminated soils in urban and suburban areas of Tamil Nadu, India

本综述通过全基因组宏基因组测序技术，深入分析了印度泰米尔纳德邦不同人为污染土壤中的微生物群落结构、抗生素抗性基因（ARGs）、重金属抗性基因（HMRs）及毒力基因（VGs）的分布特征。研究发现重金属（Pb、Cr、Cd、Cu）和烃类污染物（如十七烷、三十二烷等）与放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）等微生物丰度呈正相关，并揭示了多重耐药基因（如MexD、MexC等）主要通过外排泵机制（42%）介导抗性。该研究为环境污染与微生物适应性间的关联提供了分子证据，对制定针对性生物修复策略和评估生态恢复具有重要指导意义。

　　

1 引言

环境污染特别是重金属和烃类化合物对微生物多样性及土壤功能产生深远影响。本研究利用全基因组宏基因组测序技术，系统分析了花园（AGS）、家禽养殖场（NPS）、牛棚（CSS）、市场（TMS）、医院（THS）、热电厂（TPS）、造纸厂（PIS）和垃圾处理场（DYS）等八类地点的土壤样本，聚焦微生物组成、抗生素抗性基因（ARGs）、重金属抗性基因（HMRs）和毒力基因（VGs）的分布规律。研究假设不同重金属和有机污染物浓度的土壤具有独特的耐药组和微生物群落特征，旨在明确污染物与微生物多样性间的相互作用机制。

2 材料与方法

2.1 样本采集与处理

土壤样本采集自泰米尔纳德邦八个典型地点，每处取五个重复样本，混合后形成复合样本。样本经风干、过筛后于-80°C和-20°C分别保存用于DNA提取和理化分析。采样点环境条件一致，采用五点采样法以减少偏差。

2.2 土壤理化与重金属分析

测定土壤pH、氮、磷、总有机碳（TOC）、钾、镁、钙及铅（Pb）、镍（Ni）、镉（Cd）、铬（Cr）、锌（Zn）、铜（Cu）、锰（Mn）、铁（Fe）、铝（Al）等重金属含量。pH采用McLean法测定，重金属浓度通过原子吸收光谱（AAS）分析，波长范围200-400 nm。

2.3 气相色谱-质谱（GC-MS）分析

采用甲醇:乙酸乙酯（1:1）提取土壤有机污染物，经超声、离心后取上清液进行GC-MS分析。使用HP5MS色谱柱，程序升温从50°C至280°C，氦气为载体气体，质谱扫描范围m/z 30-900。定性分析通过Mass Hunter软件完成，定量分析基于特征离子监测。

2.4 土壤脱氢酶活性测定

以0.5 g土壤与2 mL Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）和1%三苯基四氮唑氯化物（TTC）反应，37°C避光孵育24小时后用乙醇提取甲臜（TPF），485 nm测定吸光度计算酶活性。

2.5 DNA提取与测序

使用DNeasy Power Soil Pro Kit提取DNA，经质量检测后通过Illumina Hiseq 4000平台进行全基因组测序。文库构建包括片段化、末端修复、接头连接和扩增，测序读长>450 bp。

2.6 生物信息学分析

原始数据经FastQC质控和Trimgalore去接头，使用Kraken2进行物种注释，COG和KEGG数据库进行功能注释。抗性基因通过CARD和Virulence Factor数据库比对预测，代谢途径和多样性分析借助MEGAN6、Microbiome Analyst等工具完成。统计学分析采用STAMP软件，相关性网络通过Cytoscape构建。

3 结果与讨论

3.1 土壤理化与重金属特征

样本pH呈中性至碱性，NPS样本钾（K, 1299 kg/ha）、钠（Na, 3963 kg/ha）、钙（Ca）、镁（Mg, 833 mg/kg）和总有机碳（TOC, 6.71%）含量最高。重金属中Cu（4.872 ppm）和Cd（0.316 ppm）在NPS样本中浓度最高，Pb（4.08 ppm）、Fe（169 ppm）、Cr（2.41 ppm）在AGS样本中最高，Al（628.15 mg/kg）和Mn（1889.32 mg/kg）在TPS样本中最高。CSS样本Pb、Ni、Cr、Cu浓度最低（分别为0.007 ppm、0.01 ppm、0.042 ppm、0.347 ppm），TOC仅0.114%。主成分分析（PCA）显示NPS样本与其他样本显著分离，高重金属浓度（HHMC）样本（AGS、THS、NPS）与低浓度（LHMC）样本（CSS、TMS、TPS、DYS、PIS）聚类明显。重金属间存在显著相关性，如Cu与Pb、Fe、Cd、Cr、Ca、TOC正相关，与pH负相关。

3.2 烃类污染物分布

HHMC样本中AGS的1-十二烷醇和二十二烷峰值面积较高，THS以二十二烷、三十二烷、十七烷、二十烷和邻苯二甲酸二癸酯为主，NPS富含邻苯二甲酸二乙酯、乙酸铵、角鲨烯等。LHMC样本中CSS乙酸铵含量高，PIS以2-十五烷酮为主，TMS富含癸烷、邻苯二甲酸等，TPS以1-十二烷醇和十六烷为主，DYS以十八烷和山嵛醇为主。毒性分析显示四氯乙烯、十六烷等化合物具有致癌性、肝毒性和免疫毒性，污染物以烷烃和脂肪酸为主。

3.3 土壤脱氢酶活性

脱氢酶活性（DHA）范围0.094–0.549 μg TTC g^?1 h^?1，DYS样本最高（0.549），THS最低（0.094）。方差分析表明样本间差异显著（p=0.0037）。有机质含量低的医院土壤微生物活性较低，家禽养殖场氨抑制微生物活动，而有机质丰富的市场、花园和垃圾场样本酶活性较高。造纸厂和热电厂因排放重金属和有机毒物抑制微生物活性。

3.4 测序结果概览

测序平均产出23.78±18.62百万条reads，GC含量62±0.02%，质量Phred得分35.69。微生物群落中细菌占95.47%，古菌3.11%，真核真菌0.56%，原生动物0.40%，病毒0.30%。

3.5 细菌多样性

稀疏曲线表明细菌丰度饱和。HHMC样本（AGS、THS）香农和辛普森指数较低，多样性减少；LHMC样本（CSS、TMS）多样性最高。NPS样本多样性接近LHMC组。β多样性显示HHMC与LHMC组间差异显著（p=0.049）。PCA分析中PC1和PC2分别解释97.1%和2.2%的变异，AGS和THS与LHMC样本分离，NPS与LHMC重叠。门水平上放线菌门（Actinobacteria）最优势（53.96–81.06%），其次为变形菌门（Proteobacteria, 18.58–44.96%）和浮霉菌门（Planctomycetota）。核心微生物组以纤维素堆囊菌（Sorangium cellulosum）、坎氏分枝杆菌（Mycobacterium canettii）和Conexibacter woesei为主。重金属浓度与放线菌和变形菌正相关，与Mn浓度负相关。菌种如坎氏分枝杆菌在AGS和THS中富集，纤维素堆囊菌广泛分布，黄柯卡氏菌（Kocuria flava）在DYS、THS和TMS中较多。相关性网络显示Azospirillum、Rhizobium等菌属间正相关，Nocardioides与多菌属负相关。

3.6 古菌多样性

HHMC样本古菌多样性高于LHMC，CSS多样性最高，DYS最低。PCA中PC1和PC2解释99.1%和0.6%变异，HHMC与LHMC样本分离。广古菌门（Euryarchaeota）在HHMC中占82%，LHMC中70.4%；奇古菌门（Thaumarchaeota）在LHMC中更丰富（26.1% vs 15.4%）。属水平Candidatus Nitrosocosmicus、Nitrososphaera、Methanoculleus为主，种水平Candidatus Nitrosocosmicus franklandus、Candidatus Nitrosocosmicus hydrocola和Candidatus Nitrososphaera gargensis优势。核心古菌组以上述物种为主。样本间古菌组成差异显著，如AGS富含Candidatus Nitrosocosmicus hydrocola和甲烷球菌，NPS以Nitrososphaera viennensis和Halorhabdus为主。古菌属间多呈正相关，Methanobacterium与多属负相关。

3.7 真菌多样性

HHMC样本真菌丰度更高，AGS最丰富。子囊菌门（Ascomycota）主导，其次为担子菌门（Basidiomycota）。假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudograminearum）在AGS中占95.26%， Thermothielavioides terrestris、Colletotrichum higginsianum和Drechmeria coniospora常见。核心真菌组以Thermothielavioides terrestris为主。样本间物种分布差异大，如NPS富含曲霉和塔尔菌，THS以Pyricularia oryzae为主，TMS富含Cryptococcus neoformans和Cercospora beticola。真菌与重金属正相关，如曲霉和镰刀菌具重金属耐受性。

3.8 原生动物多样性

HHMC样本原生动物多样性更高。顶复门（Apicomplexa）最优势，其次未分类原生动物和眼虫门（Euglenozoa）。属水平利什曼原虫（Leishmania）、Gaillardia、Besnoitia常见，种水平Guillardia theta、Besnoitia besnoiti、Bigelowiella natans优势。核心组以Guillardia theta、Bigelowiella natans等为主。样本间分布差异显著，如AGS富含Plasmodium cynomolgi和利什曼原虫，TMS以弓形虫（Toxoplasma gondi）为主。原生动物物种间多正相关，Plasmodium knowlesi与多物种负相关。

3.9 微生物与污染物相关性

网络分析显示微生物类群与土壤理化性质、重金属和烃类显著相关。pH与多数微生物类群负相关，与Al、Mn、Mg正相关。重金属Pb、Cr、Cd、Cu与细菌、古菌、真菌、原生动物和病毒正相关，Mn与细菌丰度负相关。细菌内放线菌和变形菌正相关，如Azospirillum与Nocardia、Streptomyces正相关。Nocardiopsis alba与Na、K、TOC、邻苯二甲酸二乙酯和四氯乙烯正相关。烷烃化合物如二十二烷与Paracoccus和Kocuria rosea正相关。古菌中广古菌门内正相关显著，Methanosarcina mazei与乙酸乙酯负相关。真菌中子囊菌和担子菌正相关，如镰刀菌与Ustilago maydis正相关。原生动物中顶复门与眼虫门正相关，如Plasmodium与Trypanosoma正相关。污染物如二十二烷与多类微生物正相关，提示微生物在污染物降解中的潜在作用。

3.10 抗生素抗性基因（ARGs）

共鉴定320个ARGs，涉及30类抗生素。二氨基嘧啶、磺胺、四环素、氟喹诺酮、利福平和氨基糖苷类抗性基因丰度最高。NPS2、CSS1、THS、TMS1和TPS样本ARGs最多。dfrE_1和sul1基因最普遍。HHMC样本（除AGS外）ARGs更丰富。抗性机制以外排泵为主（42%），其次为抗生素灭活（23%）和靶标修饰（18%）。Kocuria flava和Kocuria rosea与catB3_1、catQ_1、aadA11_1正相关。ARGs与移动遗传元件（MGEs）关联，提示水平基因转移风险。

3.11 重金属抗性基因（HMRs）

共识别350个HMRs，涉及29种金属。Cu、As、Cr、Zn、Ag、Fe抗性基因丰富，多金属抗性基因占33–53%。Cu抗性基因如ricR、copF、cusA，砷抗性基因如arsM、pstB，铁抗性基因如furA常见。基因间相关性分析显示arsM与多细菌负相关，mex_1与aioE、arsT正相关。重金属耐受机制涉及外排泵和络合作用，如CopA蛋白介导Cu外排。

3.12 代谢基因多样性

主要代谢基因包括硫酸盐还原、亚硝酸盐还原、氨氧化、脱卤、硫氧化、几丁质降解、固氮、木聚糖降解、阿特拉津代谢、芳香烃降解、木质素降解、氯酚降解、萘降解和碳固定等途径。

3.13 功能特征分析

PICRUSt功能预测显示HHMC样本中蛋白质代谢、碳水化合物、氨基酸及其衍生物和DNA代谢为主要功能类别。与AGS相比，THS和NPS样本休眠、孢子形成、噬菌体和转座元件基因更丰富；AGS样本毒力、硫代谢、铁获取和趋化基因较多。LHMC样本中噬菌体和转座元件基因比例高，提示污染物促进基因水平转移。硫代谢增强可能与半胱氨酸和甲硫氨酸合成相关。污染通过共选择压力促进抗生素抗性发展。

3.14 毒力基因（VGs）多样性

主要毒力基因包括espR、regX3、sigA/rpoV、bap、sugB等，与分枝杆菌、克雷伯菌、假单胞菌等病原体相关。蛋白互作网络鉴定14个关键基因，富集于腺病毒iva2蛋白、eccd跨膜结构域、低氧反应等通路。毒力因子如EspR调控ESX-1分泌系统，WhiB3调节脂质代谢和炎症，pks编码基因导致DNA损伤，AlgC参与LPS合成，这些基因增强病原体适应性和致病性。

4 结论

重金属和烃类污染显著影响微生物多样性、抗性机制和土壤功能。高污染区（HHMC）pH降低、脱氢酶活性下降，微生物群落以放线菌为主，适应逆境；抗性基因（ARGs、HMRs、VGs）丰度高，提示环境压力驱动微生物进化。低污染区（LHMC）微生物多样性更高，但CSS和TMS样本病原微生物和抗性基因富集，提示潜在健康风险。污染物与微生物（如Nocardiopsis、Pseudomonas、Aspergillus）的正相关性揭示其生物修复潜力。研究强调了污染环境微生物适应性机制，为生态修复策略提供理论基础。