S100A10通过调控mTOR/4E-BP通路与线粒体氧化磷酸化缓解苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大

《Frontiers in Genetics》：S100A10 knockdown exacerbates phenylephrine-induced cardiomyocyte hypertrophy via modulating mitochondrial oxidative phosphorylation

本文揭示了S100A10（S100 calcium-binding protein A10）通过与ANXA2（annexin A2）相互作用激活mTOR（mechanistic target of rapamycin）/4E-BP1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1）通路，调控线粒体呼吸链蛋白合成与氧化磷酸化（OXPHOS）功能，从而在苯肾上腺素（PE）诱导的心肌细胞肥大中发挥保护作用的新机制。

　　

1 Introduction

心力衰竭（HF）是一种多方面的临床综合征，是全球发病率和死亡率的主要原因。在长期心脏应激条件下，如慢性高血压或其他刺激，早期心脏肥大作为一种适应性机制以维持心脏功能。然而，随着应激的持续，这种代偿性反应转变为病理状态，其特征是基因转录改变、细胞外基质沉积（纤维化）和心肌细胞尺寸增大，最终损害心脏功能并导致心力衰竭。mTOR（mechanistic target of rapamycin）通路的激活已被证明通过改善蛋白质周转和线粒体功能来改善病理性心脏肥大。mTOR通路的失调与多种心血管疾病有关，包括心力衰竭。因此，更深入地理解mTOR信号与其他分子通路之间的相互作用，可以揭示驱动心脏重塑的机制，并有助于识别新的治疗干预靶点。

S100A10（也称为p11）是S100钙结合蛋白家族的成员；然而，与其他成员不同，S100A10失去了结合钙的能力。它在人体各种组织中普遍表达，在神经和肌肉系统中含量显著，并可参与多种细胞生理过程，如膜运输、细胞骨架动力学和纤维蛋白溶解。S100A10主要通过其与膜联蛋白A2（ANXA2）的相互作用发挥其功能效应，形成异源四聚体复合物。该复合物在纤溶酶原激活和血管生成等过程中起着关键作用，突出了其在细胞重塑和心血管生理学中的重要性。最近的研究表明，S100A10与ANXA2相互作用以激活mTOR通路，从而促进肿瘤糖酵解并驱动恶性肿瘤进展。这些发现强调了靶向S100A10在心脏重塑中的治疗潜力，并进一步确立了其在此过程中的作用。因此，S100A10代表了心脏肥大和心力衰竭的一个有前景的治疗靶点，尽管其精确的机制贡献值得更深入的研究。

在本研究中，我们在TAC诱导的心脏肥大、扩张型心肌病和缺血性心肌病衍生的基因集中识别出S100A10的差异表达。在体外，我们证明了S100A10通过结合ANXA2，激活mTOR/4E-BPs信号通路，并调节线粒体氧化磷酸化活性来发挥其作用。总的来说，我们的研究结果阐明了S100A10在调节线粒体氧化磷酸化活性中的关键作用，并将其确立为苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的潜在治疗靶点。

2 Materials and methods

本研究使用了来自商业来源的所有化学品和试剂。细胞培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Gibco。RNA提取和cDNA合成试剂盒购自Roche。用于蛋白质印迹和免疫共沉淀的抗体购自Cell Signaling Technology。S100a10 siRNA和对照siRNA来自Invitrogen。Seahorse XF测定试剂盒来自Agilent Technologies。细胞培养消耗品购自Servicebio。

差异表达基因（DEGs）的鉴定通过从GEO数据库下载公共数据集（登录号：GSE5500，GSE116250和GSE36961）进行。使用R语言中的DESeq2软件包进行差异基因表达分析，显著性阈值设定为调整后p值<0.05且绝对log2倍数变化>0.5。

新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）通过酶消化法从1-2天大的Sprague Dawley大鼠心室中分离出来。分离的NRVMs在补充有15% FBS的DMEM/F12培养基中培养，并维持在37°C、5% CO₂的加湿培养箱中。为了诱导肥大，用20 μM苯肾上腺素（PE）处理细胞48小时。

使用Lipofectamine? 2000按照制造商方案，用S100a10特异性siRNA或非靶向对照siRNA（终浓度20 nM）转染NRVMs。转染后十二小时，用PE处理细胞以诱导肥大。转染后48小时收集细胞用于后续分析。

使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并使用cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix以GAPDH作为内参进行qRT-PCR。

对于蛋白质印迹，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液提取蛋白质。通过BCA测定法测定蛋白质浓度。等量蛋白质通过10% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂牛奶在TBS-T中封闭，然后在4°C下与针对S100A10、ANXA2或β-tubulin的一抗孵育过夜，随后与HRP标记的二抗孵育。使用ECL显影蛋白质条带，并使用ImageJ软件进行量化。

通过将NRVMs与5 μM MitoSOX Red在37°C黑暗中孵育30分钟来测量线粒体超氧化物水平。洗涤后，通过荧光显微镜评估线粒体超氧化物水平。

使用Seahorse XF24分析仪分析细胞代谢。将NRVMs以70%汇合度接种在XF24板中，并用20 μM PE或PBS（对照）处理48小时。在基础条件下和顺序注射线粒体抑制剂（寡霉素、FCCP和抗霉素A）后测量氧消耗率（OCR）。使用Seahorse Wave Software分析数据。

NRVMs在含有蛋白酶抑制剂的IP缓冲液中裂解。通过BCA测定法进行蛋白质定量后，将500 μg总蛋白质与S100A10或ANXA2特异性抗体在4°C下孵育过夜，随后与蛋白A/G琼脂糖珠在4°C下孵育2小时。免疫沉淀的蛋白质在SDS样品缓冲液中洗脱，并通过蛋白质印迹进行分析。

数据表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。通过双尾Student t检验进行配对比较的统计学显著性确定。使用Tukey事后检验对ANOVA进行多重比较调整。p值<0.05被认为具有统计学显著性。所有分析均使用GraphPad Prism 10.0.1进行。

3 Results

3.1 Expression of S100A10 in cardiomyocyte hypertrophy

为了全面研究S100A10在心脏肥大中的表达模式，我们分析了三个独立的基因表达数据集（GSE5500，GSE116250和GSE36961），包括小鼠横向主动脉缩窄（TAC）诱导的肥大模型以及人类扩张型心肌病（DCM）和缺血性心肌病（ICM）样本。我们的分析显示，在人类HCM、DCM和ICM样本中，S100A10表达一致且显著下调。有趣的是，这种模式在TAC诱导的肥大小鼠心脏中被逆转，其中S100A10表现出显著上调。

进一步的研究表明，S100A10的表达与MYH6呈显著正相关，与利钠肽A（NPPA）呈微弱但显著的负相关。蛋白质印迹分析显示，在心肌细胞中PE刺激后，S100A10蛋白质表达显著增加。通过WGA染色进行的形态学评估揭示了预期的肥大反应，与对照组相比，PE处理的新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）表现出显著增加的横截面积。

总之，这些结果不仅建立了一个可靠的PE诱导心肌细胞肥大的体外模型，该模型以S100A10上调为特征，而且突出了S100A10在不同心肌病亚型中的差异调节，表明其在疾病发病机制中可能存在亚型特异性作用。

3.2 S100A10 knockdown exacerbates PE-Induced cardiomyocyte hypertrophy

为了研究S100A10在心脏肥大中的功能作用，我们在新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）中进行了siRNA介导的S100a10敲低。蛋白质印迹分析证实了转染的NRVMs中S100A10表达的有效沉默。在PE刺激后，我们观察到与PBS处理的对照组相比，S100a10在mRNA水平上显著上调。值得注意的是，PE处理显著上调了肥大标志物Nppa（ANP）、Nppb（BNP）和Myh7的表达，而这种效应被S100a10敲低进一步增强。

在蛋白质水平上，S100a10缺陷协同增强了PE诱导的ANP、BNP和β-肌球蛋白重链（β-MHC）的表达。在形态上，S100a10敲低显著增强了PE诱导的心肌细胞横截面积的增加，证明了其在调节肥厚性生长中的关键作用。

3.3 S100A10 interacts with ANXA2 and activates the mTOR/4E-BPs pathway

现有文献充分证明，S100A10主要与其结合伙伴膜联蛋白A2（ANXA2）以异源四聚体复合物形式存在，称为AIIt复合物。值得注意的是，S100A10表达升高已被证明有助于ANXA2在Tyr23和Ser25残基的磷酸化，随后触发mTOR信号级联的激活。为了研究这种现象是否也发生在PE诱导的心肌细胞肥大模型中，我们使用PE处理的NRVMs的蛋白质提取物进行了免疫共沉淀（Co-IP）测定。结果证实，在肥大条件下S100A10与ANXA2相互作用。基于现有证据，我们提出了一个机制模型，其中S100A10通过两个相互关联的途径调节线粒体功能：（1）调节ANXA2磷酸化状态，和（2）随后激活mTOR/4E-BP1信号轴。正如预期的那样，蛋白质印迹结果显示，PE刺激显著增加了mTOR、ANXA2和4EBP1的磷酸化水平，而S100A10的敲低进一步减弱了这些磷酸化事件，证明了其在该信号通路中的调节作用。

3.4 Knocking down of S100a10 exacerbates PE-induced mitochondrial respiratory dysfunction

Seahorse分析表明，在NRVMs中敲低S100A10会显著损害PE刺激后的线粒体功能，这通过降低的氧消耗率（OCR）、ATP产生和最大呼吸来证明。与这些观察结果一致，S100A10缺陷的心肌细胞表现出线粒体复合物蛋白水平，特别是复合物V的显著降低。此外，PE刺激导致线粒体膜电位显著下降，而S100A10敲低进一步加剧了这种情况。值得注意的是，mitoSOX染色显示，在PE刺激下，si-S100A10心肌细胞中线粒体ROS产生协同增加。

4 Discussion

在本研究中，我们研究了S100A10在苯肾上腺素（PE）诱导的心肌细胞肥大中的作用，重点关注mTOR通路激活及其对线粒体功能的下游影响。我们的研究结果表明，S100A10通过与ANXA2相互作用，调节mTOR/4E-BP信号激活，最终诱导线粒体功能障碍并加剧心肌细胞肥大。这项工作提供了第一个证据，表明S100A10通过调节呼吸链蛋白水平来调节线粒体功能——这一过程可能由mTOR/4E-BP激活介导。

S100蛋白是一个高度酸性的钙结合蛋白家族，其中一些在心脏组织中高表达。越来越多的证据表明它们参与基本的细胞过程，包括调节mTOR信号通路和线粒体功能，形成了一个独立的研究领域。细胞内钙（Ca²⁺）处理缺陷与心力衰竭的发病机制有关。发现钙传感器蛋白S100A1在人类终末期HF中显著下调。通过S100A1基因靶向治疗，即使是S100A1蛋白的适度改变也能在体外证明治疗人类心力衰竭的有效性。由于其分子特性，S100A1已成为各种体内HF模型中基因靶向HF治疗的有吸引力的靶点。S100 Ca²⁺结合蛋白家族的两个成员S100A2和S100A6具有高度序列同源性，并且它们对心脏Ca²⁺处理和收缩性的影响不同。心脏基因表达S100A2显著增强了啮齿动物和犬心肌细胞的收缩和舒张性能，模仿了其心脏同源物S100A1的功能作用。相比之下，S100A6的心脏表达对收缩力和Ca²⁺处理没有显著影响。这些数据揭示了S100蛋白对心肌细胞性能的新的差异效应，这可能有助于病变心肌的应用。转移相关蛋白S100A4在多种细胞中表达，包括成纤维细胞，并被认为是几个器官中纤维化的标志物。在Dahl大鼠高血压心脏病模型中，S100A4在肥大心肌中上调，并在向离心性心力衰竭过渡期间进一步激活。在体外心脏成纤维细胞中，S100A4敲低显著抑制了细胞增殖和胶原蛋白表达。在TAC诱导心脏重塑的小鼠中，S100A4-KO小鼠表现出间质纤维化减少、肌成纤维细胞减少以及左心室胶原蛋白和促纤维化细胞因子表达抑制，表明阻断S100A4可能通过减轻心脏纤维化而对心脏肥大和HF具有治疗潜力。近年来，中性粒细胞衍生的S100钙结合蛋白A8/A9（S100A8/A9）作为心血管疾病的重要预警蛋白引起了越来越多的关注，它对动脉粥样硬化、心肌梗死、心肌缺血/再灌注损伤和心力衰竭等心血管疾病具有多方面的影响，并被认为是诊断和预测各种心血管疾病的关键生物标志物。在一项前瞻性研究中，ACS再灌注治疗后患者HF第一天时的S100A8/A9水平准确分类了不同HF风险的患者，并可作为HF风险预测和治疗指导的强大工具。所有上述研究都证实S100a家族与心血管疾病的发生和发展密切相关。然而，作为S100a家族的成员，S100A10在心血管疾病中的研究较少。在一项关于血压和高血压全血基因表达谱的荟萃分析中，鉴定出六个与血压相关的转录本，包括S100A10。这促使我们思考压力超负荷诱导的心肌重塑过程是否与S100A10有关。首先，我们根据差异表达基因和分子生物学验证发现，在PE诱导的心肌细胞肥大过程中S100a10上调。尽管S100A10在人类DCM/ICM数据集中下调，但其在TAC小鼠和PE处理的NRVMs中的上调可能反映了模型特异性的病理生理阶段。人类心肌病通常伴有慢性纤维化微环境，代表终末期心力衰竭。相比之下，小鼠TAC模型更侧重于伴有代偿性肥大的急性压力超负荷。两者之间的病理微环境存在差异。TAC手术诱导的机械应力可能激活代偿性通路，掩盖了S100A10在人类衰竭心脏中的真实调节模式。PE诱导的NRVMs模拟了急性肾上腺素能应激，其时间过程与人类进行性心肌重塑的慢性过程不同。虽然S100蛋白的失调与心力衰竭有关，但最近的研究揭示了更广泛的机制联系：特定的S100蛋白现在因其在调节线粒体稳态和mTOR信号方面的新兴作用而得到认可，突出了超越心血管病理学的功能。关于本研究中确定的S100A10在mTOR/4E-BP通路中的调节作用，我们提出了一种受疾病阶段和物种特异性因素影响的机制。在早期代偿性肥大期间，mTOR/4E-BP通路的激活可能增强保护性蛋白（如S100A10）的翻译。相反，在终末期心力衰竭的慢性应激条件下，翻译抑制或蛋白质降解增加可能占主导地位。此外，人类和啮齿类动物之间翻译调节元件或mTOR信号组分的差异可能影响S100A10 mRNA的翻译效率和稳定性。值得注意的是，由于mTOR/4E-BP通路是蛋白质合成的核心调节器，其在不同物种或疾病阶段活性的变化可能直接调节S100A10蛋白质表达——这是转录组数据无法捕捉到的一个维度。因此，观察到的表达差异可能源于翻译而非转录调节。未来的工作应整合蛋白质合成速率的直接测量（例如，嘌呤霉素标记）与跨物种模型，以进一步阐明心脏重塑过程中S100A10的翻译控制。S100a10与MYH6之间的相关性分析结果表明，S100a10在调节代偿性心脏生长与应激反应之间的平衡中可能具有潜在的保护作用，而S100a10与NPPA显示出微弱但显著的负相关。这种弱相关性可能反映了两者共同受到其他病理因素的调节，这需要结合功能实验进一步验证。在随后的体外实验中，我们证明了S100A10敲低缓解了PE诱导的心肌细胞肥大。目前，缺乏关于S100A10在缺血性心脏病中作用的证据。S100A10是否可以作为HF风险预测和治疗指导的靶向工具仍有待进一步研究证实。

ANXA2是一种膜结合蛋白，参与心肌细胞增殖、凋亡和形态变化。已发现许多蛋白质与ANXA2相互作用产生生物学效应。例如，先前的研究表明S100A10和ANXA2显著相互作用，这提示我们应关注S100A10和ANXA2对心肌细胞肥大的可能影响。与先前研究一致，我们也在NRVMs中检测到S100A10和ANXA2之间的相互作用，并且这种相互作用在PE刺激下有增强的趋势，这可能进一步证实了ANXA2在心脏肥大中的作用。最近的研究还表明，ANXA2磷酸化在激活mTOR通路中起关键作用，这对于调节自噬和蛋白质合成等过程至关重要。与先前的发现类似，我们发现S100A10和ANXA2的相互作用激活了mTOR通路，导致下游效应器线粒体功能障碍。在本研究中，我们检测到S100A10下调抑制了线粒体氧化磷酸化。然而，有趣的是，我们还发现线粒体呼吸链蛋白表达水平下调，暗示S100A10也可能通过调节线粒体呼吸链蛋白合成来影响线粒体氧化磷酸化。先前的研究指出，由mTOR/4EBPs通路介导的蛋白质合成在心脏肥大中起重要作用。在这里，我们也检测到了mTOR/4EBPs通路的激活。虽然mTOR/4E-BP激活提示翻译控制，但直接证据（例如，嘌呤霉素掺入）尚待提供。未来的研究将量化S100A10缺陷心肌细胞中的新生蛋白质合成。先前的研究证明，S100A10-ANXA2相互作用激活AKT/mTOR信号并增强骨肉瘤细胞中的糖酵解代谢。基于跨疾病分子相似性，我们假设S100A10可能具有代谢调节功能。然而，S100A10对苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大的线粒体功能的影响是否通过糖酵解代谢介导，需要实验证实。

虽然这项研究为S100A10和ANXA2相互作用调节PE诱导的心肌肥大的机制提供了有价值的见解，但存在一些局限性。首先，虽然PE诱导的NRVMs体外模型有效地再现了心肌细胞肥大的早期表型，但缺乏在压力超负荷动物模型（例如，TAC手术小鼠）中的系统验证仍然是一个重要的限制。未来的研究应通过体内方法全面评估S100A10在器官水平的功能一致性。其次，S100A10和ANXA2之间的相互作用可能涉及其他复杂的分子机制，需要进一步探索，并且S100A10和ANXA2在心血管疾病中的临床应用需要通过更大规模的临床研究进行评估。最后，使用JC-1染色评估线粒体膜电位存在局限性，未来的研究将采用TMRE或TMRM等方法进行进一步验证。

5 Conclusion

本研究探讨了S100A10与ANXA2相互作用在PE诱导的心肌肥大中的作用，并证明S100A10通过激活mTOR/4EBPs通路，可能调节线粒体蛋白质合成和线粒体功能，从而缓解PE诱导的心肌肥大。这些发现为心血管疾病的发病机制提供了新的视角，并为未来的治疗策略提供了理论基础。