内溶素显著改善特应性皮炎症状：从研究到临床实践的桥梁

《Frontiers in Immunology》：Endolysin significantly improves symptoms with atopic dermatitis: bridging the gap from research to clinical practice

本文综述了内溶素（Endolysin）凝胶Staphyrase?在特应性皮炎（AD）治疗中的突破性进展。通过体外实验、AD样小鼠模型及临床研究（ChiCTR2500101921）证实，该疗法能特异性靶向金黄色葡萄球菌（S. aureus），显著降低皮损评分（EASI、SCORAD）、瘙痒程度（VAS）及菌群负荷（CFU），并调节炎症因子（IgE、TSLP、IL-33）。其独特机制在于通过细胞壁结合域（CBDs）水解肽聚糖，避免破坏共生菌群且不易诱发耐药性，为AD的长期主动维持治疗提供了新策略。

　　

1 引言

特应性皮炎（Atopic Dermatitis, AD）是一种以持续性瘙痒、干燥、红肿、肿胀、抓挠和丘疹化为特征的慢性炎症性皮肤疾病，是全球非致命性皮肤疾病负担的首要原因。流行病学研究显示，发达国家AD患病率持续上升，特定人群儿童患病率高达10-20%。AD因反复发作的顽固性瘙痒和缺乏根治性疗法，给患者带来沉重的社会和心理负担。慢性瘙痒导致睡眠障碍，严重降低生活质量，并增加抑郁、焦虑及自杀风险。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是AD皮损和正常外观皮肤中常见的定植菌。其释放的毒素和酶类可破坏皮肤屏障。肠毒素作为超抗原直接激活淋巴细胞，诱导或加重皮炎，同时降低组织对激素的反应性，从而影响治疗效果。一项基于培养方法的95项观察性研究的荟萃分析显示，70%的AD患者皮损中存在金黄色葡萄球菌，而非皮损皮肤或健康对照组仅为39%。另一项队列研究发现，金黄色葡萄球菌在AD患者湿疹性皮损中的分离率为69.7%，非皮损皮肤为42.4%。此外，轻度病例定植率为53%，中重度患者可达100%。在涉及60名AD儿童的研究中，也观察到类似趋势，金黄色葡萄球菌定植率与疾病严重程度成正比：轻度51.43%，中度77.78%，重度100%。一项前瞻性观察性研究还发现，儿童出生至2岁期间，金黄色葡萄球菌定植先于临床AD发作。

进一步研究表明，多种因素参与金黄色葡萄球菌在AD皮肤上的定植，包括细菌-角质形成细胞粘附增强、抗菌肽缺乏、丝聚蛋白（filaggrin）及其降解产物水平降低、Th2/Th17细胞因子过表达、微生物群失调和脂质谱改变。金黄色葡萄球菌表达的V8蛋白酶可通过激活蛋白酶激活受体1直接触发皮肤感觉神经元，这也是皮肤瘙痒的重要原因之一。此外，细菌毒力因子如酚溶性调节蛋白α（Phenol-soluble modulin α, PSMα）在人类角质形成细胞和胶带剥离的小鼠表皮模型中诱导促炎细胞因子表达。同时，δ毒素促进肥大细胞脱颗粒和IgE升高，放大皮肤炎症。金黄色葡萄球菌还表达其他几种增强症状强度的分子，包括酚溶性调节蛋白（刺激角质形成细胞释放细胞因子）、蛋白A（触发角质形成细胞炎症反应）、超抗原（诱导B细胞扩增和细胞因子释放）和促炎脂蛋白。这些发现共同强调了金黄色葡萄球菌是AD发病机制中的关键病原体，通过破坏屏障、免疫过度激活和治疗耐药性驱动疾病进展。

内溶素（Endolysins）是噬菌体编码的酶，对金黄色葡萄球菌表现出强大的溶菌活性。这些酶通过细胞壁结合域（Cell Wall-Binding Domains, CBDs）选择性水解细菌细胞壁中的肽聚糖，实现物种特异性靶向，而不破坏共生微生物群——这是相对于广谱抗生素的关键优势。例如，重组内溶素如LysM9表现出强大的抗金黄色葡萄球菌（包括耐甲氧西林菌株MRSA）活性，甚至在体外模拟皮肤条件下也是如此。此外，内溶素作用于细胞壁表面，不穿透细菌细胞质，从而避免了赋予耐药性的遗传途径的激活。

总之，AD患者正在寻求安全、无刺激、持久、经济且适用于长期主动维持治疗的药物。因此，开发基于内溶素的AD干预措施代表了一种有前景的创新策略，通过靶向抗菌活性、最小化微生物群破坏、抗炎作用和良好的安全性来满足未满足的需求。据此，本研究旨在通过综合评估一种新型基于内溶素的局部凝胶的体外抗菌活性、在具有AD样特征的小鼠模型中的疗效以及初步临床研究，来评估其治疗金黄色葡萄球菌定植AD的安全性和有效性。

2 结果

2.1 体外结果

结果说明了Staphyrase^?对金黄色葡萄球菌USA300的表征和抗菌活性。质量控样品的SDS-PAGE分析显示在约54.798 kDa处有一条单一条带，与Staphyrase^?的预期分子量一致。A260/280比值为0.785，测得浓度为6.14 mg/mL，进一步证实了样品的纯度和浓度。

图1B展示了Staphyrase^?在不同浓度下的抗菌活性。随着浓度增加，蛋白点周围的抑菌圈逐渐增大，清楚表明Staphyrase^?的抗菌效果是浓度依赖性的。此外，将Staphyrase^?应用于从AD患者皮损和皮损周围皮肤分离的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的培养物上，仅观察到对临床AD来源的金黄色葡萄球菌分离株有裂解活性，对共生的表皮葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌未检测到活性。这些结果清楚地证明了Staphyrase^?的特异性和安全性。

图1C评估了Staphyrase^?凝胶对金黄色葡萄球菌USA300的效力。阴性对照组保持了高水平的金黄色葡萄球菌，而Staphyrase^?凝胶在接触2小时后显示出金黄色葡萄球菌浓度的急剧下降，突出了其随时间推移的强大抗菌活性。

2.2 Staphyrase^?凝胶在AD小鼠模型中的体内疗效

使用具有AD样特征的感染驱动性皮炎BALB/c小鼠模型评估了Staphyrase^?内溶素对AD的治疗效果。如图2所示，展示了背部皮损的代表性图像以及炎症标志物的定量分析。

在皮损临床改善方面，基线时，模型组、莫匹罗星组和治疗组的皮肤损伤表型在胶带剥离诱导的屏障破坏和细菌攻击后具有可比性。到第7天，出现了显著的明显差异。模型组在整个处理区域出现严重的发红、脱屑和水肿。相比之下，Staphyrase^?组皮肤外观明显改善，与模型组相比发红和脱屑减少。对照组在整个研究期间无病理变化。

关于疾病严重程度评分，皮损的定量评估显示，与模型组相比，Staphyrase^?组的疾病严重程度显著降低。模型组显示最高评分，表明严重的AD样症状，而Staphyrase^?组的评分与对照组相似，突显了其治疗效果。

皮肤匀浆的生物化学分析和皮损拭子的微生物学分析显示，模型组的IgE水平和金黄色葡萄球菌CFU细菌载量均显著高于对照组。Staphyrase^?治疗导致金黄色葡萄球菌CFU和IgE水平显著下降，表明有效控制了细菌定植并减轻了全身过敏反应。

在炎症细胞因子调节方面，皮肤匀浆的RT-qPCR分析显示炎症细胞因子表达存在显著波动。模型组显示TSLP水平上调，以及IL-33表达增加。Staphyrase^?治疗显著抑制了IL-33以及TSLP表达。促炎细胞因子IL-1β在模型组中显著升高，但在Staphyrase^?治疗后显著降低。这些发现共同证明，Staphyrase^?通过多层次调节屏障功能障碍、过敏致敏和细胞因子介导的炎症来减轻AD样病理。尽管莫匹罗星治疗组在皮损、金黄色葡萄球菌负荷以及促炎细胞因子水平方面与模型组相比有显著改善，但AD患者中莫匹罗星耐药金黄色葡萄球菌的日益流行引起了人们对长期使用局部抗生素的担忧。

2.3 Staphyrase^?凝胶改善AD症状和EASI评分

20名研究参与者被纳入研究，均为符合Hanifin标准的成年男女性AD患者，入组时EASI ≤ 21。所有研究参与者均完成研究，无耐受性问题。

治疗前后的疗效结果如表1所示。临床评估包括EASI、SCORAD、IGA、VAS和DLQI，在基线、第7天和第14天进行测量。使用R软件进行非参数Wilcoxon符号秩检验以评估随时间推移的个体内变化。结果如下：与基线期相比，所有评分指标在第7天均显著下降；在第14天，评分较基线期进一步下降，证明了Staphyrase^?凝胶的时间依赖性疗效。值得注意的是，EASI、VAS和DLQI评分从第7天到第14天仍显示出显著的下降趋势，表明第二周期间皮损严重程度、瘙痒和患者生活质量持续改善。

疗效观察显示，受试者nb13为男性。使用Staphyrase^?凝胶治疗14天后，颈部和肩胛部发红和水肿显著消退，EASI从5.9降至1.2，VAS从9降至1。受试者nb20为女性，急性期。治疗后，足部丘疹、抓痕和发红明显改善，EASI从5.05降至2.7，瘙痒VAS从10降至2。受试者nb14的面部丘疹、水肿和发红，以及受试者nb07肘窝的丘疹和抓痕均显著改善，证明了Staphyrase^?凝胶对急性和慢性AD皮损的疗效。

病例受试者nb11显示，使用Staphyrase^?凝胶治疗8周后皮损显著改善。足部发红、抓痕和干燥的临床表现显著缓解。连续评估显示所有指标持续改善：EASI从基线10.6降至第14天9.2，进一步降至第8周4.0；SCORAD从基线62.4降至第14天53.56和第8周26.8；IGA从基线5分降至第14天3分和第8周1分；VAS从基线6分显著降至第14天3分和第8周0.8分；DLQI从基线11分改善至第14天7分和最终1分。

6名受试者达到EASI 50+，6名受试者达到SCORAD 50+，12名受试者DLQI改善超过4分。短期临床目标通常为12周，但本研究在2周内，部分患者指标已达到短期治疗目标。

3 讨论

AD是一种以瘙痒、干燥、发红和水肿为特征的慢性炎症性皮肤疾病，对生活质量有显著影响。金黄色葡萄球菌通过定植于皮损和非皮损皮肤，导致炎症和皮肤屏障功能障碍，在加剧AD中起着关键作用。金黄色葡萄球菌释放的毒素和酶可破坏皮肤屏障并诱导免疫反应，导致疾病严重程度增加。

基于内溶素的疗法，如Staphyrase^?凝胶，成为AD的一种新型治疗策略。内溶素是噬菌体编码的酶，通过水解细菌细胞壁中的肽聚糖选择性靶向金黄色葡萄球菌，实现物种特异性溶菌，而不对共生微生物群造成附带损害。这种特异性至关重要，因为它降低了产生抗生素耐药性的风险，这是传统抗生素的一个重要问题。来自本研究及先前研究的临床证据证明了Staphyrase^?凝胶治疗轻中度AD的安全性和有效性，EASI、SCORAD、IGA、VAS和DLQI评分显著改善。

长期使用Staphyrase^?凝胶可能提供一个减轻炎症和促进表皮屏障修复的治疗机会。通过抑制金黄色葡萄球菌，该凝胶可以潜在地减少炎症负荷并让皮肤屏障恢复，从而缓解瘙痒并改善生活质量。然而，本研究存在局限性。样本量小和开放标签设计限制了统计效力，并限制了对更广泛AD人群的普适性。此外，短的随访期无法评估长期安全性、持续疗效和复发率。未来的研究应旨在招募更多参与者并进行随机对照试验，以进一步验证这些发现并评估长期结果。

值得注意的是，该临床项目的局限性包括其开放标签设计和有限的患者入组，这可能会影响结果的普适性。此外，更长期的数据对于确定持续抑制金黄色葡萄球菌是否能打破AD慢性复发-缓解周期尤为关键，这是当前管理中的一个关键未满足需求。尽管存在这些局限性，该研究为使用内溶素作为AD的靶向疗法提供了有希望的证据，突出了改善患者结局和减少对传统疗法依赖的潜力。

4 材料与方法

4.1 内溶素凝胶

Staphyrase^?凝胶按照良好生产规范制备，配方包含32 μg/mL Staphyrase^?内溶素、海藻酸钠、氯化钙、甘油、纯化水。

4.2 Staphyrase^?内溶素的表达和蛋白纯化

Staphyrase^?内溶素通过大肠杆菌表达系统生产，进行重组表达和内溶素蛋白纯化。

蛋白纯化分四个连续步骤进行：首先使用镍-氮川三乙酸亲和层析，采用20 mM、50 mM、100 mM和400 mM的咪唑洗脱梯度分离重组内溶素。随后用PreScission蛋白酶酶切过夜，去除His标签，并进行反向Ni-NTA层析，使用20 mM、40 mM和400 mM咪唑梯度去除未切割的蛋白和残留的His标签中间体。然后应用阴离子交换层析去除核酸污染物。最后使用Lambolide MD55-7-5透析膜进行透析， against 由1×PBS、300 mM NaCl和10%甘油组成的缓冲液，以实现缓冲液交换并浓缩蛋白。

为去除内毒素，使用Kingsley ToxinEraser?内毒素去除试剂盒处理样品，然后通过鲎试剂显色法使用Kingsley ToxinSensor?显色法LAL内毒素检测试剂盒进行定量检测。最终的Staphyrase^?内溶素制剂以2–4 mg/mL的浓度分装，并于-80°C储存以保持稳定性。

4.3 针对金黄色葡萄球菌和其他共生菌的体外方法

从-80°C冰箱取出金黄色葡萄球菌USA300甘油储备菌，接种到胰蛋白酶大豆肉汤培养基中进行活化培养。孵育后，用磷酸盐缓冲盐水稀释10倍作为工作菌悬液。内溶素样品从-80°C储存解冻，并在生物安全柜中避光条件下用缓冲液稀释至最终浓度32、64和128 μg/mL。将无菌一次性拭子浸入稀释的USA300悬液中，在管壁上挤掉多余液体以确保均匀接种。然后将拭子均匀涂抹在胰蛋白酶大豆琼脂平板上。将每种稀释样品点样到接种的TSA平板上。风干后，平板于37°C培养，培养后观察细菌裂解区。

从AD皮损和邻近皮肤区域分离的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行培养并均匀划线到TSA平板上。同时，痤疮丙酸杆菌在适当的厌氧条件下在BHI琼脂平板上培养。孵育后，将Staphyrase^?或缓冲液点样到相应琼脂平板的接种表面。风干后的平板随后在37°C倒置培养。孵育期后评估裂解活性。

为评估Staphyrase^?凝胶对金黄色葡萄球菌USA300的效力，将菌株复苏并培养至对数生长期。然后用无菌PBS洗涤菌悬液两次，并调整至最终浓度8.8 × 10⁹ CFU/mL用于后续实验。接着，将Staphyrase^?凝胶和阴性对照凝胶分别以1:1的体积比加入USA300悬液中，充分混合后分别在37°C孵育2小时和3小时。在每个时间点，无菌收集100 μL等分试样并进行10倍系列稀释。将适当稀释度均匀涂布在TSA平板上，一式三份，并于37°C培养过夜。孵育后，选择含有30-300个菌落的平板，使用公式计算活菌数。该方法符合评估细菌存活率的标准微生物学实践。

4.4 建立感染驱动的AD样小鼠模型

动物研究方案经深圳市零一生命科技有限公司机构审查委员会批准。将6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为四组：1）阴性对照组；2）Staphyrase^?内溶素组；3）模型组；4）莫匹罗星组。

在第0天，用2%异氟烷麻醉小鼠，剃除背部毛发，用酒精湿巾擦拭，最后用压敏胶带剥离20次。将金黄色葡萄球菌接种到内溶素组、模型组和莫匹罗星组剥离皮肤的小鼠背部皮肤上。阴性对照组在剥离皮肤上施用等体积生理盐水。

从第1天到第7天，阴性对照组每天给予100 μL生理盐水一次，靶标组接受50 μL Staphyrase^? + 50 μL金黄色葡萄球菌，莫匹罗星组接受50 μL莫匹罗星 + 50 μL金黄色葡萄球菌，模型组接受50 μL金黄色葡萄球菌 + 50 μL生理盐水，每天一次。第7天后，收集皮损拭子并培养用于金黄色葡萄球菌CFU定量。用湿润PBS的无菌拭子反复擦拭背部皮损区域，然后浸入1 mL TSB中进行菌落计数。取样的TSB管进行系列稀释，将100 μL稀释液涂布到甘露醇盐琼脂平板上。涂布后，平板在37°C培养24小时后进行菌落计数。遵循动物福利和伦理考虑，通过腹腔注射2.5% avertin深度麻醉小鼠。通过眶后穿刺采血，随后通过颈椎脱位进行伦理安乐死。然后采集皮肤组织。

4.5 促炎细胞因子的RT-PCR分析

安乐死后，从背部皮损中央区域采集皮肤组织。使用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent按照制造商说明提取总RNA。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，按照提供的逆转录方案，从1 μg总RNA合成互补DNA。

定量分析IgE、IL-1β、TSLP和IL-33炎症因子以及金黄色葡萄球菌CFU，以Gapdh为内参。所用序列如表2所示。

4.6 小鼠皮炎评估

雌性BALB/c小鼠背部皮损的疾病严重程度评分如下：0分-无症状；1分-轻度红斑伴最小局灶性脱屑；2分-中度弥漫性脱屑和红斑强度增加；3分-≥50%背部区域融合性脱屑、中度红斑和局灶性水肿；4分-严重全身性脱屑、融合性强烈红斑和涉及整个背部皮肤的明显水肿。

4.7 参与者

从2025年5月至2025年7月，在深圳市前海蛇口自由贸易区医院招募了20名AD患者。纳入标准：1）年龄18-70岁，性别不限；2）符合Hanifin & Rajka AD诊断标准；3）筛选和基线时EASI评分≤21分。本研究遵循赫尔辛基宣言原则，方案经深圳市蛇口自由贸易区医院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。所有患者每天两次涂抹Staphyrase^?凝胶。

4.8 临床指标评估

EASI评分参考Hanifin的文章，计算公式为：EASI评分 = 头/颈部面积评分 × 头/颈部总严重程度评分 × 0.1 + 上肢面积评分 × 上肢总严重程度评分 × 0.2 + 躯干面积评分 × 躯干总严重程度评分 × 0.3 + 下肢面积评分 × 下肢总严重程度评分 × 0.4。

SCORAD评分：综合评估皮损面积、客观体征和主观症状。A. 皮损面积：根据受累体表面积百分比评分，范围0至100。B. 客观体征：发红、肿胀、渗出/结痂、抓痕、苔藓化和皮肤干燥。每个体征按严重程度分级0至3，总体征评分0至18。C. 主观症状：瘙痒程度及其对睡眠的影响分别评分0至10分。总SCORAD评分计算公式为：总分 = A/5 + 7B/2 + C。总分范围0至103分。≤24分表示轻度AD，25–50分表示中度AD，>50分表示重度AD。

IGA评分由研究者在每次临床访视时使用6分制评估参与者的整体临床体征。瘙痒严重程度通过10厘米VAS测量，0表示“无瘙痒”，10表示“严重瘙痒”。参与者在每次访视时通过标记刻度自我报告瘙痒程度。DLQI评估六个领域的健康相关生活质量：症状和感受、日常活动、社交和休闲活动、工作和学习、个人关系以及治疗相关影响。每个项目按4分制评分，总分范围0至30。较高的DLQI评分反映生活质量受损较大。在所有随访访视中系统记录不良事件，以进行安全性监测。研究开始前，所有研究者均接受方案特定培训。监测人员定期进行现场访视，以确保符合监管标准，保障参与者安全和隐私，并验证数据的准确性和完整性。

4.9 数据分析

使用GraphPad Prism 9.0.0软件分析动物指标。使用单因素方差分析进行多重比较的统计分析，并使用Dunnett进行比较检验。人体指标评分的差异分析基于EASI、SCORAD、IGA、VAS和DLQI评分。对于每个评分，分别应用R软件Wilcoxon符号秩检验在基线、第7天和第14天进行。P < 0.05被认为具有统计学显著性。

5 结论

使用含有靶向金黄色葡萄球菌的内溶素的Staphyrase^?凝胶，成为AD一种有前景的治疗策略。通过选择性解决细菌定植和减少炎症负荷，这种新型干预措施有效管理急性和慢性皮肤病变，缓解瘙痒，并改善AD患者的关键临床结局。