COVID-19 mRNA疫苗心肌炎新机制：ceRNA调控IL-6表达及对疫苗设计的启示

《Frontiers in Immunology》：Exploring ceRNA mechanisms in COVID-19 mRNA vaccine-induced myocarditis: implications for future vaccine design

本综述深入探讨了COVID-19 mRNA疫苗（BNT162b2）诱导心肌炎的分子机制，揭示了体外转录（IVT）mRNA作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过海绵吸附hsa-let-7f-5p，解除其对白细胞介素-6（IL-6）mRNA的抑制，从而触发心肌细胞炎症反应和凋亡的新通路。研究强调了在下一代mRNA疫苗序列设计中规避关键microRNA结合位点的重要性，为提升疫苗安全性提供了理论依据。

　　

引言

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）全球大流行，促使了有效疫苗的快速开发和部署。在各种疫苗平台中，mRNA疫苗因其快速的开发时间表和已证实的高效性而成为一种突破性方法。然而，与这些疫苗相关的潜在不良反应，特别是心肌炎，已引起重大关注。心肌炎以心肌炎症为特征，由于其可能导致严重的心脏并发症而备受关切。流行病学研究已建立了COVID-19 mRNA疫苗接种与心肌炎发病率增加之间的相关性，尤其是在年轻男性中。尽管有这些发现，但这种疫苗相关不良反应的确切分子和细胞机制在很大程度上仍不清楚，凸显了迫切需要进一步研究以改进当前和下一代mRNA疫苗的安全性。

为了获得机制上的见解，一些研究采用了动物模型来模拟疫苗暴露并研究潜在的免疫病理学结果。例如，有研究报告，对BALB/c小鼠高剂量静脉注射COVID-19 mRNA疫苗可诱导多灶性心肌炎和心包炎，并伴有心脏白细胞介素-6（IL-6）和其他促炎标志物的升高，表明存在强烈的全身炎症反应。这些发现支持了mRNA疫苗可能通过免疫学途径间接导致心肌炎症的观点。在这些途径中，炎症细胞因子（如IL-6——炎症性疾病的核心介质）的异常调节在疫苗诱导的免疫反应背景下受到越来越多的关注。此外，竞争性内源RNA（ceRNA）网络在调节免疫和炎症反应中的新兴作用，为疾病发病机制中的转录后调控提供了新的视角。

ceRNA，包括mRNA、长链非编码RNA和环状RNA，通过竞争性结合共享的microRNA（miRNA）来调节基因表达，从而调控多种细胞过程。miRNA是一类保守的小非编码RNA，通过抑制靶基因的表达发挥关键调节作用。ceRNA网络的破坏可导致分化、凋亡和增殖等生物过程失衡，从而引发各种炎症性疾病和癌症。具体而言，COVID-19疫苗引入的外源mRNA可能作为ceRNA，吸附内源性miRNA，从而扰乱免疫介质的调节平衡。然而，ceRNA介导的机制在mRNA疫苗诱导的心肌炎背景下的作用在很大程度上仍未探索。

材料与方法

本研究采用人源心肌细胞系（AC16）转染含有N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰的体外转录（IVT）mRNA来模拟疫苗暴露，并研究与mRNA暴露相关的心肌炎症下游分子变化。

细胞培养：AC16人源心肌细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中，于37°C、5% CO₂的加湿环境中培养。

IVT mRNA制备：使用含有T7启动子序列、5‘非翻译区（UTR）、3’ UTR、110核苷酸分段poly(A)尾和用于 runoff 转录的SapI限制性内切酶位点的pmRVac载体，通过Gibson组装技术构建包含SARS-CoV-2刺突糖蛋白编码序列的DNA模板。在体外转录过程中，用N1-甲基假尿苷（m1Ψ）替代天然尿苷。使用牛痘病毒加帽系统产生Cap1 mRNA。通过磁珠纯化加帽转录本，并测量其浓度和纯度。

mRNA转染：当AC16心肌细胞融合度达到60-80%时，使用Lipo8000?转染试剂转染IVT mRNA（0.1 μg/mL）。转染后24-48小时收集细胞用于后续分析。

炎症细胞因子测定：使用Luminex液相悬浮芯片和BioPlex蛋白阵列定量分析细胞上清液中的21种炎症细胞因子。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进一步验证IL-6蛋白水平。

细胞凋亡检测：使用膜联蛋白V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒，通过流式细胞术评估心肌细胞凋亡水平。

心肌损伤标志物检测：通过ELISA试剂盒测量细胞上清液中的肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和心肌肌钙蛋白I（cTn-I）水平。

RNA免疫共沉淀（RIP）：使用抗Ago2抗体和对照IgG进行RIP实验，验证IVT mRNA、IL-6 mRNA与特定miRNA在Ago2蛋白复合物中的结合。

双荧光素酶报告基因检测：将含有IVT mRNA或IL-6 mRNA的3‘UTR野生型（Wt）或突变型（Mt）序列克隆至荧光素酶报告基因载体中。将报告基因载体与miRNA模拟物共转染AC16细胞，检测荧光素酶活性变化，以验证miRNA与靶标mRNA的直接结合。

拷贝数分析：采用绝对定量方法，通过标准曲线计算AC16细胞中IL-6 mRNA和let-7f-5p的拷贝数。

结果

IVT mRNA的结构：辉瑞- BioNTech COVID-19 mRNA疫苗（BNT162b2）的序列包含5‘-帽、5’ UTR、SARS-CoV-2刺突糖蛋白编码序列、3‘UTR和poly(A)尾五个关键元件。

IVT mRNA诱导促炎反应和心肌细胞凋亡：Luminex芯片检测显示，转染IVT mRNA后，AC16心肌细胞上清液中多种炎症细胞因子水平发生变化，其中IL-6的上调最为显著。ELISA和RT-qPCR结果进一步证实了IL-6在蛋白和mRNA水平的显著升高。在脂多糖（LPS）诱导的炎症条件下，IVT mRNA进一步加剧了IL-6的分泌。此外，IVT mRNA转染显著促进了心肌细胞凋亡，并在LPS炎症条件下加剧了凋亡。同时，IVT mRNA显著提高了心肌损伤标志物CK-MB和cTn-I的分泌水平。

IVT mRNA作为let-7f-5p的海绵且IL-6是let-7f-5p的下游靶标：通过TargetScan、miRDB和miRTarBase数据库预测，并结合RNAhybrid数据库分析，发现多个miRNA（包括miR-98-5p、let-7a-5p、let-7f-5p）可能同时与IVT mRNA和IL-6 mRNA的3‘UTR结合。RIP实验证实，这些miRNA以及IVT mRNA和IL-6 mRNA均能被抗Ago2抗体共沉淀。RT-qPCR显示，转染IVT mRNA后，let-7f-5p的表达水平下降。双荧光素酶报告基因实验表明，转染let-7f-5p模拟物能显著降低含有野生型IVT mRNA-3’UTR或野生型IL-6 mRNA-3‘UTR的报告基因的荧光素酶活性，而对突变型结合位点的报告基因活性无显著影响。拷贝数分析显示，每个AC16细胞中IL-6和let-7f-5p的拷贝数具有可比性（IL-6约83.70拷贝，let-7f-5p约62.27拷贝）。RT-qPCR分析进一步证实，IVT mRNA转染可增加IL-6表达，而let-7f-5p模拟物可逆转此效应。

讨论

本研究揭示了与COVID-19 mRNA疫苗相关的心肌炎的分子机制，重点强调了ceRNA介导的IVT mRNA与IL-6之间的串扰。研究结果表明，IVT mRNA可作为ceRNA，通过吸附hsa-let-7f-5p，解除其对IL-6 mRNA的转录后抑制，从而增强AC16心肌细胞的炎症反应。这些发现强调了在下一代mRNA疫苗序列设计中避免关键miRNA结合位点以提高安全性的重要性。

本研究的结果与先前关于mRNA疫苗促炎特性的研究一致。临床观察也支持IL-6在mRNA疫苗接种后升高，这与我们的发现相符。因此，对于有潜在炎症性疾病的个体，mRNA疫苗的安全性值得关注。

N1-甲基假尿苷（m1Ψ）是COVID-19 mRNA疫苗中的关键化学修饰，显著增强了安全性和有效性。其主要优势在于降低免疫原性，同时提高mRNA稳定性和蛋白表达。然而，最近有研究发现m1Ψ可能在翻译过程中诱导核糖体移码，产生非预期的蛋白产物，这可能引发脱靶免疫反应。这一发现揭示了mRNA设计中一个未被充分认识的风险，它与ceRNA介导的免疫原性不同但可能具有叠加效应。

本研究提出的ceRNA假说扩展了RNA串扰的范式，表明外源IVT mRNA能够竞争性吸附miRNA（如let-7f-5p）来调节疾病相关基因（如IL-6）。为了降低风险，建议在当前mRNA设计流程中整合miRNA反应元件（MRE）规避算法。

本研究存在一些局限性。所有实验均在AC16心肌细胞系中进行，未能完全模拟体内心脏微环境的复杂性。ceRNA机制的体内相关性仍需在动物模型和临床样本中验证。分析仅限于转染后的短期细胞反应，未评估mRNA暴露对心肌细胞的长期或累积效应。未来的研究需要采用体内模型、患者来源样本和系统水平的方法来证实和扩展这些发现。

结论

本研究揭示了外源mRNA疫苗可通过ceRNA竞争无意中失调内源基因网络，例如通过let-7f-5p介导的IL-6过表达。这一发现挑战了治疗性mRNA仅作为被动抗原模板的传统观点，揭示了其作为抗原蓝图和转录后调节因子的双重作用。为确保翻译保真性和生物安全性，未来的mRNA疫苗必须采用能最大限度减少miRNA海绵活性的序列设计，从而推动精准RNA治疗学的发展。