枯草芽孢杆菌Krd-20新菌株VKM B-3516D的生物防治潜力：应对小麦赤霉病与黄斑病的可持续农业策略

《Frontiers in Sustainable Food Systems》：Exploring the potential of new Bacillus subtilis strain VKM B-3516D against common wheat diseases for sustainable farming system

本综述重点评价了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）新菌株Krd-20 (VKM B-3516D)在防治小麦主要病害方面的潜力。研究通过质谱分析、PCR及基因组注释证实，其抑菌活性源于脂肽类物质（如fengycin和surfactin）的产生。田间试验显示，基于该菌株的可湿性粉剂生物农药对小麦赤霉病（FHB）和黄斑病（YLS）的生物防治效果达75–83%，且与矿物肥料（如18:18:18 "Universal"）兼容性良好。此外，该生物农药的应用显著提高了根际土壤的生物抑病能力（增加21.1%），降低了谷物感染率，并使作物产量提升2.5%。这些发现表明，B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D作为一种有效的生物农药，有助于推动可持续农业系统的发展。

　　

引言

小麦是全球广泛种植的主要粮食作物，具有重要的农业和经济价值。然而，真菌病害，如黄斑病、叶枯病、白粉病、各种锈病、黑穗病以及根腐病等，严重制约了冬小麦的生产。其中，由镰刀菌属（Fusarium）病原体引起的小麦赤霉病（FHB）是小麦、大麦和玉米最具破坏性的病害之一，不仅导致作物减产，还因霉菌毒素积累而对食品安全构成威胁。因此，在可持续农业框架下，开发有效的病害管理策略至关重要。

近年来，生物防治方法日益受到重视。细菌制剂，特别是基于假单胞菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）的生物农药，在全球生物杀菌剂市场中占据主导地位。枯草芽孢杆菌因其能够产生具有广谱抗真菌活性的脂肽类次级代谢产物而成为研究热点。这些脂肽主要包括surfactin、iturin和fengycin三大类，它们通过破坏病原菌细胞膜结构、诱导植物系统抗性等多种机制发挥生物防治作用。

目前，俄罗斯市场上缺乏足够数量的、基于枯草芽孢杆菌并能有效保护谷物作物免受主要病害侵袭的注册生物农药。这凸显了开发新型高效生物防治解决方案的必要性。本研究旨在分离、鉴定一株具有拮抗活性的枯草芽孢杆菌新菌株Krd-20 (VKM B-3516D)，开发其作为生物杀菌剂，并评估其对小麦主要病害的防治效果及其与矿物肥料的兼容性。

材料与方法

菌株分离与鉴定

研究于2020年从俄罗斯克拉斯诺达尔地区小麦根际表层土壤中分离得到一株具有拮抗活性的枯草芽孢杆菌新天然菌株。通过扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）方法，利用特异性引物对16S rRNA基因区域进行扩增和限制性内切酶分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，并保藏于全俄微生物保藏中心，保藏号为VKM B-3516D，其16S rRNA基因部分序列已提交至GenBank（登录号MW227473）。

脂肽的分离与鉴定

采用酸沉淀法从菌株培养液中分离脂肽。培养液经离心去除培养基成分和菌体后，将上清液冷却至4°C，用盐酸调节pH至2，静置后离心收集沉淀。沉淀用蒸馏水重溶，并加入两倍体积的冷乙腈进行萃取，获得含有脂肽的溶液。采用MALDI-TOF质谱法对脂肽提取物进行分析，以鉴定其组成。同时，利用针对FenD、ItuD和SrfC合成酶基因的特异性引物进行PCR扩增，并通过水平电泳验证相关基因的存在。

此外，通过共培养法评估了该菌株对禾谷镰刀菌（F. gramineárum）和小麦黄斑病菌（P. tritici-repentis）的体外拮抗作用。

生物杀菌剂制备与相容性评价

菌株在100升生物反应器中培养后，通过低通量离心分离获得菌体。菌体与热保护剂（马铃薯淀粉与水按1:5比例混合）混合后，进行喷雾干燥，制得可湿性粉剂形式的生物杀菌剂。

评估了该生物杀菌剂与水溶性矿物肥料18:18:18 "Universal"的相容性。将孢子悬浮液与肥料工作液按比例混合，定期检测混合液中活菌数（CFU/g）的变化，持续观察12个月。

田间试验

田间试验于2022–2024年在俄罗斯克拉斯诺达尔边疆区的克拉斯诺达尔国立农业大学实验站进行。供试小麦品种为Bezostaya 100。试验设三个处理：1）1%的18:18:18 "Universal"肥料溶液与B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D生物杀菌剂干粉按99:1比例混合施用（施用率2.7 kg/ha）；2）单独施用1%的18:18:18 "Universal"肥料溶液；3）空白对照（不处理）。处理在小麦抽穗期进行两次叶面喷施。在病害发生高峰期，采用Babayants等级评估法调查叶片发病情况，计算病情指数和生物防治效果。收获时测定谷物产量，并采集样品进行品质分析。

土壤真菌学分析

采集小麦根际土壤样品，进行十倍系列稀释后，接种于Czapek培养基上，于28°C培养7天。计数并鉴定腐生和植物病原真菌的菌落数。计算土壤生物抑病指数，即抑病真菌种类数与植物病原真菌种类数之比。

谷物感染评估

收获后的小麦谷物经表面消毒后，置于添加抗生素的PDA平板上，于24°C黑暗培养7–14天。记录从谷物上长出的真菌菌落，并鉴定其种类。计算谷物感染率。

谷物品质评估

使用专用仪器测定谷物的容重、千粒重、蛋白质含量、硬度、湿面筋含量等品质指标。

统计分析

所有数据均进行正态性检验。采用单因素方差分析（ANOVA）比较不同处理对各测定指标的影响，当p < 0.05时认为差异具有统计学意义。

结果

菌株鉴定与脂肽特性

PCR分析证实所研究菌株属于枯草芽孢杆菌，并已保藏为VKM B-3516D。MALDI-TOF-MS分析在m/z 1036.9和1454.1处分别检测到对应于surfactin和fengycin的质谱峰，表明该菌株能产生这两种环状脂肽。PCR扩增和电泳结果显示，该菌株基因组中含有iturin和surfactin合成酶基因，但未检测到fengycin D组（fenD）合成酶基因。

体外拮抗试验

共培养试验表明，B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D对F. graminearum和P. tritici-repentis均具有明显的拮抗作用，能够抑制病原菌气生菌丝和基质菌丝的生长，并在菌落周围形成清晰的抑菌圈。

相容性评价

生物杀菌剂与18:18:18 "Universal"肥料混合后，初始活菌数为1.04 × 10¹⁰ CFU/g。储存12个月后，活菌数降至1.2 × 10⁹ CFU/g。结果表明，矿物肥料对微生物存活率的影响很小，表明二者可以成功配制成复合制剂。

田间病害防治效果

喷雾干燥得到的生物杀菌剂成品为浅棕色粉末，易溶于水，活菌数达2 × 10¹¹ CFU/g。田间试验中，对照区的黄斑病发病率为60%，赤霉病发病率为20%。施用B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D生物杀菌剂后，对黄斑病和赤霉病的生物防治效果分别达到83.4%和75%。

土壤生物抑病性

从根际土壤中共分离鉴定出9个属的324株病原性和条件致病性微霉菌，其中曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）最为优势。单独施用矿物肥料的处理区土壤抑病指数最低（4.11单位），空白对照区为5.61单位，而生物杀菌剂与肥料联合处理区的土壤抑病指数最高，达21.11单位。这表明B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D能够抑制病原菌和腐生菌的生长，从而增强根际土壤的抑病能力。

谷物感染、产量与品质

谷物真菌学分析表明，主要检出菌为链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）和长蠕孢属（Helminthosporium）真菌。单独施用肥料处理区的谷物感染率最高（30.0–56.7%），对照区次之（41.0–46.7%），而生物杀菌剂与肥料联合处理区的感染率最低（10.0–23.3%），差异显著（F = 5.8352, p = 0.0391）。

在产量方面，生物杀菌剂与肥料联合处理获得了最高产量，但与单独施肥或对照相比，差异未达到显著水平（F = 0.126, p = 0.883）。在谷物品质方面，联合处理显著提高了蛋白质含量（F = 7.252, p = 0.0063）和湿面筋含量（F = 8.1437, p = 0.004），但对谷物硬度的影响不显著（F = 0.806, p = 0.4651）。谷物容量在不同处理间也存在显著差异（F = 4.1034, p = 0.0293）。

总体而言，基于B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D的生物杀菌剂能有效控制小麦常见病害，使产量提高2.5%，显著改善谷物品质，并使根际生物抑病性较对照提高73.43%。

讨论

本研究通过MALDI-TOF-MS分析证实了菌株Krd-20 VKM B-3516D能够产生环状脂肽。这些脂肽通过嵌入病原菌细胞膜、改变其通透性以及诱导植物抗性等多种机制发挥抑菌作用。PCR结果显示该菌株含有iturin和surfactin合成酶基因，但缺乏fenD基因，而质谱却检测到fengycin信号。这种差异可能源于环境条件诱导了其他fengycin组别（如fenC, fenE等）基因的表达，或存在基因序列突变。

在脂肽分离方法上，本研究选择酸沉淀法，并通过MALDI-TOF质谱成功鉴定出surfactin和fengycin的同系物。值得注意的是，该菌株产生的fengycin谱图强度约为surfactin的两倍，这与某些以往研究中surfactin占主导的情况不同，表明脂肽的产生比例受菌株特性和培养条件影响很大。

生物农药与化学肥料的相容性对其实际应用至关重要。本研究发现矿物肥料对B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D的存活影响甚微，这与多数研究认为芽孢杆菌属制剂通常与矿物肥料兼容的结论一致。其他研究也表明，较低比例的矿物肥料可能更有利于芽孢杆菌在土壤中的存活和增殖。将生物制剂与化学投入品结合使用的集成策略显示出协同增效的潜力。

土壤真菌学分析表明，施用B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D与矿物肥料能显著提高土壤的生物抑病指数。这归因于该菌株抑制病原菌和部分腐生菌生长的能力。大量研究证实了不同枯草芽孢杆菌菌株对多种土传病原菌的抑制作用。同时，枯草芽孢杆菌还能促进有益微生物的生长，改善土壤微生物区系。

本研究的田间试验结果与先前多项研究相符，证实了芽孢杆菌在控制小麦病害方面的有效性。B. subtilis Krd-20 VKM B-3516D已被证实具有内生特性，这可能有助于其促进种子生产力、刺激植物防御反应和促进植物生长，从而间接贡献于产量提升。尽管本研究观察到产量增加的趋势，但产量受多因素影响，未来研究需采用多因子设计和先进统计方法以精确量化各因素的贡献。

谷物品质的改善可能与菌株增强植物养分吸收能力和有效的病害控制有关。研究表明，镰刀菌感染会负面影响小麦品质，而有效的生物防治则有助于维持或提升谷物品质。

从工业应用角度看，基于该菌株的干制剂生物农药具有保质期长、易于储存和运输等优势，非常适合在偏远地区推广使用。

结论

本研究证实枯草芽孢杆菌Krd-20 VKM B-3516D菌株对禾谷镰刀菌和小麦黄斑病菌具有显著的拮抗活性。质谱分析表明其产生fengycin和surfactin脂肽。基因组注释证实其含有surfactin和iturin合成酶基因。以此菌株为基础开发的干粉生物农药，在田间条件下对小麦黄斑病和赤霉病的生物防治效果高达85%。与矿物肥料按1:99比例配施，能增强小麦根际土壤的抑病能力，提高作物对病原菌侵染的抵抗力，并对产量和谷物品质（如蛋白质和面筋含量）产生积极影响。因此，该生物杀菌剂是一种推动向环境友好型农业系统转型的有前景的工具，有助于有机农业实践和全球绿色经济的发展。