LPAR6介导溶血磷脂酸调控子宫内膜蜕膜化：为反复种植失败提供新治疗靶点

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Lysophosphatidic acid promotes endometrial decidualization in recurrent implantation failure patients by regulating LPAR6

本文揭示了溶血磷脂酸（LPA）通过其受体LPAR6（而非LPAR1）调控人子宫内膜基质细胞（hESCs）蜕膜化的新机制。研究发现反复种植失败（RIF）患者子宫内膜中LPA水平显著降低，且LPAR6表达下调。通过体外实验证实LPA-LPAR6轴可促进蜕膜标记物（IGFBP1/PRL）表达和细胞骨架重组，为RIF的病理机制提供了新见解并提示LPAR6作为潜在治疗靶点。

　　

引言

不孕症是全球范围内影响约13%夫妇的公共卫生问题。尽管辅助生殖技术（ART）取得了显著进展，但反复种植失败（RIF）仍然是制约临床妊娠率的主要障碍。RIF是一种病因复杂、多因素导致的疾病，甚至缺乏国际公认的统一定义。越来越多的证据表明，子宫内膜蜕膜化受损是导致胚胎植入失败的主要原因。蜕膜化是子宫内膜基质纤维母细胞转化为特化的分泌性蜕膜细胞的过程，能够产生胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP1）和催乳素（PRL）等标记物，为胚胎植入和生长提供必需环境。

代谢组学为探索生物样本的代谢状态提供了有力工具。先前研究表明，在激素替代治疗患者中，子宫内膜转化期间血清代谢物发生显著变化；蜕膜化与非蜕膜化子宫内膜的代谢谱存在显著差异；与植入成功的女性相比，RIF患者中存在8种代谢物发生改变。然而，专门针对RIF患者子宫内膜组织的代谢组学研究相对较少。

方法

本研究经医院伦理委员会批准（2013-408081-01），所有参与者均签署知情同意书。RIF定义为连续三次以上胚胎移植且累计移植超过四个高质量卵裂期胚胎或两个高质量囊胚后未能获得临床妊娠。对照组为因男性因素不孕接受辅助生殖治疗并在首次胚胎移植后成功妊娠的患者。

研究排除了有以下情况的个体：反复妊娠丢失（两次及以上生化妊娠或两次及以上流产）、不良妊娠史、或任何明确的胚胎植入失败原因，包括但不限于中重度宫腔粘连、子宫内膜薄（转化前小于7毫米）、子宫腺肌症、子宫内膜异位症、子宫肌瘤（粘膜下肌瘤、非粘膜下肌瘤大于4.0厘米和/或压迫子宫内膜）、未处理的输卵管积水、生殖道畸形、严重免疫性疾病、严重凝血异常、内分泌系统疾病、夫妻一方染色体核型异常、妊娠禁忌症或辅助生殖技术禁忌症、传染病、性传播疾病或支原体/衣原体感染。

代谢组学分析在10例RIF患者和10例有生育能力的对照组患者的子宫内膜组织中进行。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统进行分析，使用metaX进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）鉴定差异表达代谢物（DEMs），筛选标准为变量重要性投影（VIP）>1、倍数变化（FC）>1.2或FC<0.833、p<0.05。

从有生育能力的对照组女性分泌期子宫内膜组织中分离原代人子宫内膜基质细胞（hESCs），并通过波形蛋白和E-钙黏蛋白免疫荧光鉴定基质细胞纯度。建立体外蜕膜化模型，使用1μM甲羟孕酮（MPA）和0.5mM 8Br-cAMP处理hESCs。为了阐明油酰-LPA对蜕膜化的影响，使用0.1μM和1μM浓度的油酰-L-α-溶血磷脂酸处理hESCs。

通过RT-qPCR、ELISA、免疫荧光、CCK-8增殖实验、Western blotting和免疫组织化学等技术，研究LPA及其受体（LPAR1-6）在蜕膜化过程中的功能作用。使用针对LPAR6的小干扰RNA（siRNAs）进行基因敲低实验。

结果

代谢组学分析显示，在正离子和负离子模式下，质量控制（QC）样本均呈现紧密聚类，表明数据采集过程中仪器稳定性高。共鉴定出39种正离子模式DEMs和15种负离子模式DEMs。主成分分析（PCA）和PLS-DA得分图显示RIF组与对照组之间存在明显分离聚类。置换检验结果证实PLS-DA模型稳健，预测能力强。值得注意的是，溶血磷脂酸（LPA）在两种离子模式下均被鉴定为差异丰富的代谢物。在正离子模式下，LPA的FC值为0.56，p值为0.009；在负离子模式下，FC值为0.29，p值为0.032。

为进一步验证RIF组中LPA水平降低，检测了LPA合成（ATX、PLA1和PLA2）和降解（PPAP2A、PPAP2B和PPAP2C）关键酶的mRNA表达。结果显示，与LPA合成相关的基因ATX和PLA1在RIF组中轻微下调但无显著性，而与LPA降解相关的PPAP2B和PPAP2C在RIF中显著上调。这些发现表明，RIF中LPA水平的显著降低可能是由于其合成适度减少和降解显著增强共同导致。

对GEO数据库中人类子宫内膜转录组数据的分析显示，在GSE111974数据集中，LPAR3显著上调，LPAR6显著下调；在GSE58144数据集中，LPAR2显著上调，LPAR6显著下调。临床样本验证证实，LPAR1、LPAR5和LPAR6在RIF组中显著下调。

原代hESCs分离鉴定显示基质细胞纯度达98.54%。在蜕膜化过程中，LPAR1和LPAR6高表达。LPA处理（1μM）显著增加IGFBP1和PRL的mRNA水平以及PRL蛋白水平。F-肌动蛋白染色显示预期的细胞骨架重组和形态变化，细胞从长梭形变为更大、更圆形的形态。LPA对细胞增殖无显著影响。

功能实验表明，抑制LPAR1对IGFBP1和PRL mRNA水平、PRL蛋白分泌以及细胞骨架组织均无显著影响。相反，LPAR6敲低显著降低IGFBP1和PRL mRNA表达，减少PRL蛋白分泌，并破坏细胞骨架形态。LPAR1抑制或LPAR6敲低均不影响细胞增殖。

Western blotting和免疫组织化学染色显示，RIF患者子宫内膜中LPAR6蛋白表达低于对照组，且LPAR6蛋白在分泌期的表达高于增殖期。在hESCs中，抑制LPAR6后，LPA不再对IGFBP1和PRL mRNA水平以及PRL蛋白水平产生影响。值得注意的是，抑制LPAR6后加入LPA并不能挽救IGFBP1和PRL的表达。

下游机制探索显示，RIF组与对照组之间mTOR、P-mTOR和PTEN蛋白水平无显著差异。LPA对P-mTOR和PTEN表达无显著影响，但显著降低mTOR表达。抑制LPAR6对PTEN表达无影响，但意外上调mTOR和P-mTOR表达。

讨论

蜕膜化对于子宫内膜容受性的建立和成功胚胎植入至关重要。我们的研究结果基于整合多组学方法。对RIF女性和对照组子宫内膜组织的代谢组学分析显示LPA水平显著改变，并得到LPA代谢酶表达失调的支持。公共GEO数据库和临床样本的转录组数据进一步表明LPA受体表达异常，特别是LPAR6在RIF子宫内膜中持续下调。

LPAs是通过自体毒素（ATX）从膜磷脂代谢衍生的普遍存在的生物活性磷脂。LPA可通过6种G蛋白偶联受体（LPAR1-6）发出信号，调节多种生殖过程包括受精、蜕膜化、植入和妊娠维持。我们的多数据集生物信息学分析显示RIF中LPAR2、LPAR3和LPAR6表达异常。基于它们在体外蜕膜过程中的高表达，我们聚焦于LPAR1和LPAR6。功能研究表明，只有LPAR6敲低而非LPAR1抑制损害蜕膜化，表现为IGFBP1/PRL表达抑制和细胞骨架组织破坏。

尽管LPAR6研究尚不充分，但其在癌症进展和生存以及动物早期妊娠适应中的参与凸显了其生物学重要性。我们的结果确立了LPAR6在人类蜕膜化和RIF发病机制中的关键作用。我们进一步证明LPAR6蛋白表达在RIF子宫内膜中降低，在分泌期升高，与容受性中的功能作用一致。挽救实验证实，在LPAR6抑制的hESCs中，LPA无法促进蜕膜化，表明LPAR6是介导LPA在此过程中作用的主要受体。

为探索下游机制，我们评估了蜕膜化核心的PTEN/mTOR通路。虽然PTEN是PI3K的负调控因子，通常在蜕膜化中上调，但我们观察到其对LPA或LPAR6抑制无显著反应。相反，LPA下调mTOR表达，而LPAR6抑制增加mTOR和磷酸化mTOR水平。这些看似不一致的结果表明LPA-LPAR6信号与mTOR活性之间存在环境依赖的串扰，需要进一步研究以阐明精确的调控网络。

本研究存在若干局限性。首先，代谢组学分析使用的样本量相对有限，可能制约了其他有意义的代谢物的识别，并降低了研究结果对抗个体差异的稳健性。其次，体外hESC模型虽然信息丰富，但不能完全重现复杂的体内子宫内膜微环境，特别是与免疫细胞、内皮细胞和上皮成分的相互作用。最后，需要使用LPAR6敲除小鼠或已建立的RIF动物模型进行体内研究，以确认靶向LPA-LPAR6轴的生理相关性和治疗潜力。

结论

我们的整合代谢组学-转录组学-功能方法揭示，LPA在RIF患者子宫内膜中显著下调，并确定失调的LPA-LPAR6信号轴是蜕膜化受损的关键因素。我们进一步证明LPAR1和LPAR6在hESCs蜕膜化过程中均高表达，但功能实验确定LPA通过LPAR6而非LPAR1促进蜕膜化。这些发现为RIF的发病机制提供了新的机制见解，并强调LPAR6作为改善受影响患者子宫内膜容受性的有希望的治疗靶点。