综述：人类疟原虫配子体发生诱导：从应激到基因组编辑

《Frontiers in Microbiology》：Induction of gametocytogenesis in human malaria parasites: from stress to genome editing

这篇综述系统梳理了人类疟原虫配子体发生（gametocytogenesis）的诱导策略，从传统的环境应激方法（如高寄生血症、营养剥夺）到前沿的基因组编辑技术（如CRISPR/Cas9）。文章重点解析了关键调控因子PfAP2-G、GDV1和HP1在性承诺（sexual commitment）中的核心作用，并指出整合两种策略对开发高效诱导方法、推动疟疾（malaria）传播阻断研究和疫苗研发的重要意义。

　　

1 引言

疟疾是一种由疟原虫（Plasmodium）引起的致命性疾病，尽管其历史可追溯至公元前500年，但高效疫苗的研发至今仍是巨大挑战。全球每年仍有数亿感染病例。疟原虫通过雌性按蚊（Anopheles）在宿主间传播，而配子体（gametocyte）是唯一能感染蚊子的阶段，因此在疟疾传播链中扮演着关键角色。随着疟原虫对常用裂殖体杀灭药物（schizonticidal drugs）的耐药性日益增强，以配子体为目标的传播阻断（transmission-blocking）策略显得尤为重要。大规模生产有活性的配子体，对于抗疟药物筛选、疫苗开发（如Sanaria公司的PfSPZ疫苗）及基础研究都至关重要。

2 配子体发生及其调控

配子体发生是疟原虫从无性阶段向有性阶段——配子体转变的过程。这一性承诺（sexual commitment）决定在无性周期中就已做出，其核心调控分子是转录因子AP2-G（PfAP2-G）。AP2-G属于ApiAP2家族，能激活400多个早期配子体发生相关基因的表达，其缺失会完全阻断配子体形成。

在恶性疟原虫（P. falciparum）中，AP2-G的表达受到表观遗传机制的精密调控。在无性状态下，ap2-g基因座被异染色质包裹，其标记物H3K9me3和异染色质蛋白1（HP1）使其处于沉默状态。GDV1（Gametocyte Development 1）蛋白在此过程中发挥上游调控作用：它响应环境信号（如营养可利用性），与HP1相互作用并将其从ap2-g基因座驱逐，从而解除抑制，启动AP2-G的表达。AP2-G随后通过正反馈环路巩固性承诺。

不同疟原虫物种的配子体出现时间和成熟速度存在差异。例如，P. falciparum配子体通常在发热后10-12天出现于外周血，而P. knowlesi配子体则在1.5-2天内快速成熟，但其在血流中的寿命较短。

3 应激诱导的配子体发生

实验室中诱导配子体发生的主要方法是模拟宿主体内应激环境。常用的应激源包括：

高寄生血症（通常>8%）是强有力的诱导因素。通过与其它应激源（如裂解未感染红细胞-LUE、寄生虫条件培养基-CM、营养剥夺）结合，其效果进一步增强。“崩溃法”（crash method）是一种传统技术，通过不添加新鲜红细胞使无性寄生率升高后崩溃，引发营养应激，从而触发配子体发生作为生存机制。

条件培养基（CM）源自高寄生率培养物，富含寄生虫分泌因子和代谢物。研究表明，添加CM可显著提高配子体产率，转换率可从~0.3%提升至14%-24%。大规模生产方案则结合CM、降低血细胞比容、高寄生血症和LUE等多种应激源，能从10mL培养物中获得数亿配子体。

无血清培养（-SerM）技术近年来受到关注。用AlbuMAX? II（一种富含脂质的牛血清白蛋白）联合ITS-X（胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠和乙醇胺）替代人血清，不仅能降低成本、避免批次差异，还能提高配子体产量和蚊媒感染性。脂质成分（如乙醇胺）对膜磷脂合成至关重要，可能满足配子体更高的脂质需求。

乳酸补充也被用作诱导信号。寄生虫在体外培养中能产生毫摩尔级别的乳酸，高浓度乳酸（>16 mM）可能作为应激信号，抑制无性繁殖并促进性分化。研究表明，持续补充8.2 mM乳酸能显著增加配子体密度。

裂解未感染红细胞（LUE）悬浮液模拟了患者体内红细胞碎片积累的情况，其中游离血红蛋白可能是触发性分化的未知因子之一。然而，LUE的效果可能因虫株而异。

抗疟药（如双氢青蒿素-DHA）暴露也可能影响性转换。研究表明，在滋养体期使用低剂量DHA处理，可使性承诺率从<10%显著升高至~40%，这支持了“终末投资”（terminal investment）假说，即生存受威胁时，寄生虫转向配子体生产。

4 理解配子体发生的遗传操作方法

遗传操作技术为在分子水平上解析配子体发生的调控机制提供了精确工具。

早期方法如双同源重组（double homologous recombination）曾用于基因敲除（如ap2-g敲除证实了其必要性）。PiggyBac转座子插入突变（PiggyBac transposon mutagenesis）则通过随机插入筛选到多个配子体发育缺陷的突变体。药物选择（如阿托伐醌-atovaquone筛选细胞色素b突变体）也帮助鉴定了与传播能力相关的基因。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现带来了革命性变化，实现了高效、精准的基因修饰。研究人员利用CRISPR/Cas9对GDV1进行内源性标记（如3×HA），清晰揭示了GDV1在环境信号（如胆碱剥夺）下上调，并通过驱逐HP1解除对ap2-g的抑制。条件性基因敲除系统（如GDV1Δ39截短突变体）进一步表明，即使定位和相互作用功能保留，蛋白量不足也无法达到性承诺的诱导阈值。

可诱导配子体生产者（iGP）品系的创建是一项重要进展。通过将条件性GDV1过表达盒插入cg6基因座，并使用Shield-1调控，可实现约75%的高效、同步性转换，产生强壮且具有传播能力的配子体，为研究晚期配子体生物学和评估传播阻断干预提供了强大平台。

对HP1的功能域（染色结构域、铰链区、染色阴影域）进行CRISPR/Cas9介导的条件性缺失研究发现，任一功能域的缺失都会导致异染色质崩溃和ap2-g的剧烈去抑制，引起近乎完全的性转换，证实了HP1是发育命运不可或缺的表观遗传守门员。

可诱导CRISPR干扰/激活（CRISPRi/a）系统进一步扩展了工具包。利用dCas9与GCN5或Sir2a融合，可在不引入永久突变的情况下表现遗传调控基因表达，实现了ap2-g的>10倍诱导和配子体形成的四倍增加，且所有过程均在DiCre/loxP系统下受rapamycin严格诱导控制。

对其他靶点的探索也揭示了新的调控层面。例如，敲除棕榈酰转移酶PfDHHC9虽不影响无性生长，但显著损害配子体形成，提示蛋白质棕榈酰化（palmitoylation）是性分化的新调控层。敲除胞质乙二醛酶基因PfcGlo2意外地增加了性承诺，表明S-D-乳酰谷胱甘肽或其相关代谢中间体的积累可能作为内部应激信号，倾斜向性分化的平衡。

5 结论

诱导配子体发生的多种策略凸显了这一过程的复杂性。应激方法虽实用，但未能完全模拟自然感染中的生理触发因素。分子方法深化了我们对性承诺调控网络的理解，但尚未转化为跨疟原虫物种的大规模配子体生产实用工具。未来，桥接机械性方法和分子方法，利用从一方获得的见解来优化另一方，对于实现大规模配子体发生至关重要。这方面的进展将直接推动全球疟疾控制，因为可靠的大规模配子体生产不仅是加速发现传播阻断药物的关键，也是依赖蚊媒感染和子孢子收获的疫苗研发策略所不可或缺的。最终，将我们对配子体发生的理解转化为实用的实验室平台，将释放出治疗和疫苗创新的管道，使疟疾消除的目标更接近现实。