日粮添加牡蛎肽对母猪繁殖性能、免疫应答及仔猪生长的影响研究

《Frontiers in Veterinary Science》：Effects of dietary oyster peptide supplement on litter performance, immunological response of sows and growth performance of piglets

本研究探讨了在妊娠后期和哺乳期母猪日粮中添加牡蛎肽（OPI）的效果。结果表明，OPI补充能显著提高健康仔猪数、断奶存活率及初乳中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）水平，并上调胎盘营养转运载体基因（GLUT4、SLC2A1、SNAT1、LAT1、FABP3）、抗氧化基因（SOD1、SOD2、GPX2、CAT）及抗凋亡基因（BCL2、BCL2L1）表达，同时下调促炎因子（IL-1、IL-6、IL-8、AVPI1）。OPI通过增强胎盘功能、改善免疫与抗氧化状态，有效提升母猪繁殖性能与仔猪健康。

　　

1 引言

现代动物育种与繁殖技术的应用使得母猪的窝产仔数显著增加，但同时也带来了诸如低出生体重、弱仔发生率高、仔猪存活率低、发病率高以及断奶窝重下降等一系列挑战。同窝中，低出生体重仔猪摄入的初乳和乳汁量均低于高出生体重仔猪，这对仔猪的生长、繁殖性能及生活质量产生了不利影响。研究证实，妊娠后期母猪与胎儿之间的物质交换加剧，营养摄入对胎儿生长至关重要。常规的营养物质转运，如氨基酸和糖类，不足以满足胎儿的生长发育需求。此外，妊娠可能引发的氧化应激会导致低出生体重仔猪的发生率增加。因此，妊娠后期的充足营养和抗氧化产品补充对于母猪健康和活仔数至关重要。

肽已被证明在促进繁殖和改善窝产性能方面效果显著，且不干扰母体蛋白质摄取途径，是理想的营养补充剂。牡蛎肽（OPI）已被证明具有增强免疫力、抗氧化和抗炎等功能活性。据报道，OPI表现出高抗氧化活性，并能促进细胞生长。此外，OPI能有效增强MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化。其他研究表明，OPI具有抗炎特性，能够抑制炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的表达，有助于增强机体免疫系统。我们推测，在妊娠后期母猪日粮中添加OPI可以降低氧化应激水平，增强免疫力，并加强母猪与胎儿之间的营养转运。因此，本研究旨在探讨在妊娠后期和哺乳期母猪日粮中添加OPI对窝产性能、母猪免疫应答以及仔猪生长发育的影响。

2 材料与方法

2.1 实验材料

本实验所用OPI由中国科学院天津工业生物技术研究所营养资源生物合成研究组提供。应用时按推荐剂量添加，以确保实验条件的准确性和标准化。

2.2 实验动物与设计

实验于2023年9月在河北省廊坊市永清县瑞佳农业发展有限公司进行。共选取100头妊娠90天、蹄部健康、体况良好的加拿大长白×约克夏母猪。将选定的母猪随机分为两组：对照组（CON组）饲喂基础日粮，实验组在基础日粮中添加2 mg/kg OPI。饲喂期从妊娠90天至产后21天，每组50头母猪。分别根据妊娠期和哺乳期母猪的营养需要选择相应的基础日粮。

2.3 饲养管理

分娩前，各组母猪均饲养在圈舍中。产前一周，将动物转入产房，并全部分配到独立的产栏中。环境保持清洁干燥，定期通风、照明，温度控制在25°C，并定期进行消毒程序。妊娠母猪每天饲喂两次（5:00和16:30），每次饲喂1.5 kg饲料。分娩当天，妊娠母猪饲喂量减少（1.2 kg/次，每天两次），分娩后1-2天逐渐恢复饲喂量（1.3 kg/次，每天两次）。哺乳母猪每天饲喂三次（5:00、10:30和16:30），每次饲喂2 kg。所有母猪均可自由获取清洁饮水，以维持其正常生理功能。

2.4 样品采集

分娩期间，每组随机选择7头母猪进行样品采集。母猪分娩时，用短线结扎脐带，并为每头仔猪标记编号标签，以便将个体仔猪与其胎盘匹配。胎盘排出并称重后，采集胎盘样本，在液氮中速冻（距脐带插入点3-4 cm），然后于-80°C保存直至分析。

初乳样本在排出第一头仔猪时采集。初乳采样前，用肥皂和水清洗整个可见乳房并用于纸擦干。随后，通过均匀按摩进行手工挤奶收集初乳，然后于-80°C保存直至分析。

2.5 母猪和仔猪数据测量

在分娩日，记录每头母猪的窝产仔数、活产数、死胎数、木乃伊胎数以及个体仔猪出生重。根据出生体重区分弱仔和健仔。健仔出生体重大于900 g，弱仔出生体重小于900 g。在哺乳期第7、14和21天，记录个体仔猪体重。存活率通过活仔数除以总产仔数计算。

2.6 免疫球蛋白水平分析

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测分娩母猪初乳中的免疫球蛋白（IgA、IgE、IgG、IgM）浓度。测定程序根据相关猪ELISA试剂盒说明书进行。具体操作如下：首先进行标准品梯度稀释处理，然后将标准品和待测样品加入酶标板。随后在37°C孵育30分钟。然后用洗涤液洗涤5次。随后加入酶试剂，并在37°C再孵育30分钟。再次洗涤5次。最后加入显色液，并在37°C孵育10分钟。用紫外分光光度计读取450 nm处的吸光度。

2.7 RNA测序

每组随机选择同一头母猪的3个胎盘样本进行转录组分析。首先，使用Trizol试剂盒提取样本的总RNA，并使用NanoDrop 2000检测总RNA的浓度和质量。随后将富集的mRNA反转录为cDNA，对cDNA末端进行修复、纯化和扩增。将得到的cDNA文库与Novaseq 6000联用，获得所有基因的定量和注释信息。

对于RNA测序分析，首先通过从原始数据中去除含有接头、聚N和低质量的reads获得干净reads。接着，使用TopHat2软件将reads比对到猪基因组。使用Cuffquant和cuffnorm估算所有转录本的表达水平，并通过计算FPKM分析mRNAs的表达水平。当调整后的FDR <0.05且log2（差异倍数）绝对值大于1.3时，使用DESeq2 R包筛选两组之间的差异表达基因（DEGs）。使用TBtools对DEGs的火山图和热图进行聚类。使用GOseq R包对DEGs进行Gene Ontology（GO）富集分析，以评估其生物学意义。

2.8 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

RNA样本与转录组分析所用相同。使用SYBR荧光染料的QRT-PCR检测细胞中基因的mRNA表达水平，PCR条件如下：95°C 2分钟，随后进行40个循环的95°C 5秒和60°C 30秒。每个实验重复四次。最后，使用2^?ΔΔCT方法量化基因表达，并选择GAPDH作为内参基因。用于扩增每个基因的引物列于表中。

2.9 统计分析

本实验的数据分析使用SPSS进行。首先检测所有数据是否符合正态分布。使用独立样本t检验比较两组间仔猪数量和体重，使用卡方检验比较两组间健仔率和活仔存活率。所有结果均以平均值±标准差表示。设定p ≤ 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 妊娠后期日粮添加OPI对母猪分娩性能的影响

结果表明，在母猪妊娠后期补充OPI导致弱仔数显著减少（2.02 ± 2.31 vs. 1.23 ± 1.39, p ≤ 0.05）。OPI组的健仔率显著提高（92.01 ± 8.79 vs. 87.10 ± 12.97, p ≤ 0.05）。

3.2 OPI对哺乳期仔猪生长性能的影响

母猪日粮添加OPI可显著提高7日龄活仔窝重（29.45 ± 7.54 vs. 32.75 ± 6.77, p ≤ 0.05）。与CON组相比，OPI组14日龄活仔数（10.61 ± 2.37 vs. 11.63 ± 1.85）、14日龄活仔窝重（43.98 ± 10.67 vs. 49.49 ± 10.57）和14日龄仔猪存活率（77.81 ± 15.14 vs. 83.45 ± 11.91）均显著增加（p ≤ 0.05）。OPI补充可显著提高21日龄断奶活仔数（10.32 ± 2.35 vs. 11.44 ± 1.77, p ≤ 0.05）、21日龄活仔窝重（59.22 ± 16.40 vs. 67.81 ± 14.46, p ≤ 0.05）和断奶存活率（75.74 ± 15.69 vs. 82.22 ± 12.08, p ≤ 0.05）。

3.3 OPI对母猪初乳中免疫球蛋白水平的影响

OPI补充可显著提高分娩母猪初乳中IgA、IgG和IgM的浓度（p ≤ 0.05）。

3.4 补充OPI的母猪胎盘中转运载体、抗氧化和免疫基因的表达

与CON组相比，OPI组胎盘中葡萄糖转运载体（GLUT4、SLC2A1）、氨基酸转运载体（SNAT1、LAT1）、脂肪酸转运载体（FABP3）和抗氧化基因（SOD1、SOD2、GPX2、CAT）的表达水平均显著升高（p ≤ 0.05）。抗凋亡基因（BCL2、BCL2L1）在OPI组中的表达也显著更高（p ≤ 0.05）。OPI补充显著降低了母猪胎盘中促炎因子（IL-1、IL-6、IL-8、AVPI1）的表达水平，并显著提高了抗炎因子（IL-10）的表达水平（p ≤ 0.05）。

3.5 胎盘转录组学分析

基于转录组学的PCA分析，OPI组的表达谱与CON组明显不同。本实验在CON组中共鉴定出13,215个已知基因，其中847个独特表达。在OPI组中共鉴定出12,712个已知基因，其中344个独特表达。两组之间共有730个差异表达基因（DEGs），与CON组相比，OPI组中有111个基因上调，619个基因下调。热图展示了前20个DEGs。

为了进一步探索OPI功能的分子机制，对DEGs进行了GO和KEGG分析。GO分析表明，DEGs主要与骨骼系统发育、多细胞生物过程调控、结缔组织发育和质膜相关。大多数DEGs富集在细胞过程、代谢过程、生物调控（生物过程）；结合、转运活性、分子转导活性、分子功能调节（分子功能）以及细胞、膜和大分子复合物的组成（细胞组分）等方面。

KEGG富集分析表明，DEGs主要与代谢信号传导和皮质醇合成、分泌相关，包括代谢途径、蛋白质消化、甲状旁腺激素合成和ABC蛋白转运。

随机选择的8个DEGs（CXCL10、CCL4、DNAJB1、FBLN7、SATB2、SGK2、IL1RN、POF1B）在CON组和OPI组中进行了qRT-PCR验证。这些基因在qRT-PCR和RNA-seq中的相对表达水平变化方向相似。该结果验证了测序数据的可靠性。

4 讨论

胎儿在母猪妊娠后期生长和发育最快，能量、蛋白质和脂肪显著增加。先前的研究表明，生物活性成分可以通过改善消化功能、抗炎和增强抗氧化特性来提高生长性能。另一项研究显示，在母猪日粮中添加N-氨基甲酰天冬氨酸二肽可增加仔猪的窝重，并提高仔猪的存活率。本研究使用了毕赤酵母生产的OPI。它是一种混合物，其纯度不是通过肽含量来衡量，而是通过其抗氧化性能来衡量。该混合物富含蛋白质、牛磺酸、糖原等营养物质。由于OPI的添加剂量为2 mg/kg，其中的蛋白质和其他营养物质对饲料营养成分的影响非常小，因此OPI更多地被视为一种活性添加剂。

然而，此前尚无关于OPI补充对母猪窝产性能、免疫应答影响的研究。如我们所预期，本研究中添加OPI导致健仔数（健仔出生体重≥900 g）、断奶活仔数、断奶窝重和断奶存活率显著增加。本研究中显示的OPI增强免疫力、抗氧化和抗炎的功能与先前的研究一致。

胎盘是连接胎儿和母体的器官，在促进胎儿营养摄入方面起着至关重要的作用。任的研究表明，添加活性肽CC34可显著增强绵羊氨基酸转运载体的相对表达。王的研究表明，添加蜜蜂抗菌肽Api-PR19可显著提高葡萄糖和脂肪酸转运载体的表达水平。本研究结果表明，OPI可促进母猪胎盘中葡萄糖（GLUT4、SLC2A1）、氨基酸（SNAT1、LAT1）和脂肪酸（FABP3）转运载体的表达。同时，健仔数增加，弱仔数减少。因此，OPI可能通过其营养组分和改善胎盘转运功能来帮助提高母猪的生产性能。

在妊娠后期，母体免疫系统减弱，易受炎症因子影响。炎症是机体对各种损伤因素（如感染、创伤、异物等）产生防御反应的基本病理过程。据报道，仔猪的免疫系统在妊娠期间由胎盘塑造，并在出生后通过初乳进一步发育。Hwang等人发现，OPI通过抑制NF-κB通路减轻了脂多糖诱导的炎症反应，并显著降低了促炎因子的表达水平。钱等人也得出了类似的结论，断言OPIs具有抗炎特性，能够缓解脂多糖对巨噬细胞造成的氧化应激。根据上述报告，可以得出结论，OPI发挥了一定程度的抗炎作用。我们的研究结果还显示，补充OPI后胎盘中抗炎因子（IL-10）显著增加。此外，母猪初乳中的免疫球蛋白大幅增加，从而增强了仔猪的免疫力并提高了存活率。这可能是由于补充OPI后母猪的整体免疫水平得到提高，导致初乳中免疫球蛋白水平升高。

母猪和仔猪在妊娠后期和哺乳期氧化应激更加明显，直到断奶后才恢复。氧化应激与死胎和弱仔的增加直接相关。已确定升高的ROS可诱导血管内皮细胞自噬、功能障碍和凋亡，导致胎盘血管系统发育受损，从而引起宫内胎儿发育受限。王等人观察到，给小鼠施用OPI导致ROS显著降低，SOD和GSH-Px显著增加，从而显著增强了小鼠的抗氧化特性。严等人指出，OPI可能通过结合ROS并与抗氧化酶相互作用来发挥抗氧化作用。在本研究中，添加OPI可提高SOD、GSH-Px和CAT的表达水平，这与先前的研究一致。这表明OPI增强了母猪胎盘的抗氧化特性，这可能是健仔增加的重要原因。

为了研究OPI的作用机制，对胎盘进行了q-PCR和转录组分析。OPI组中促炎因子（IL-1、IL-6、IL-8）降低，而抗凋亡基因（BCL2、BCL2L1）的表达增加。此外，还鉴定出与胎盘转运和抗炎相关的关键基因。这些结果在mRNA水平上为OPI对母猪繁殖性能的潜在作用机制提供了依据。

5 结论

在母猪妊娠后期和哺乳期日粮中添加OPI是改善窝产性能、母猪免疫应答和仔猪生长性能的有效途径。OPI补充可提高胎盘中抗氧化和营养转运基因的表达，这可能有助于提高仔猪出生体重和增加健仔数。此外，它还能增强母猪和初乳的免疫功能，强化仔猪被动免疫，提高断奶窝重和存活率。