腺苷酸琥珀酸合成酶1（Adss1）缺失通过上调甘油激酶（Gk）促进脂肪组织甘油再酯化改善能量代谢

《Advanced Science》：Adenylosuccinate Synthase 1 Deficiency Improves Energy Metabolism by Promoting Adipose Tissue Re-esterification via Glycerol Kinase Upregulation

本研究发现，腺苷酸琥珀酸合成酶1（Adss1）缺失通过重塑组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的核质分布，降低其核内活性，从而增强甘油激酶（Gk）启动子区域的组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac），上调Gk表达。该机制促进了脂肪细胞内甘油依赖性脂肪酸再酯化循环，驱动了脂质合成与氧化代谢，最终激活米色脂肪产热程序，改善全身能量代谢并抵抗饮食诱导的肥胖。

　　

2.1 适应性产热刺激诱导脂肪组织中Adss1表达

为探究嘌呤核苷酸代谢酶在冷激活脂肪组织中的转录调控，研究将野生型C57BL/6J雄性小鼠暴露于4°C环境24小时和7天。分析显示，棕色脂肪组织（BAT）和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中酶的表达模式存在明显差异。与既往研究一致，分解代谢酶Gmpr和Gda在BAT和iWAT中的表达均在冷暴露后显著上调。值得注意的是，冷暴露诱导了嘌呤核苷酸生物合成酶表达的显著改变。具体而言，Adss1和Adss2在iWAT和BAT中的表达均增加。iWAT的反应尤为强烈，冷暴露7天后，Adss1的表达较对照组小鼠增加了近20倍，而Adss2仅显示中度上调。这些转录变化在蛋白质水平得到进一步验证，免疫组化分析证实iWAT中Adss1蛋白水平升高。相比之下，BAT的反应更为温和，冷暴露后Adss1和Adss2的表达仅轻微增加。这些发现凸显了冷适应过程中嘌呤代谢酶的组织特异性转录调控，iWAT的Adss1上调尤为显著。

研究进一步检测了在β-肾上腺素能刺激和运动训练两种不同生理条件下Adss1的表达模式。使用β-肾上腺素能激动剂CL316243处理7天后，观察到iWAT中Adss1表达显著上调十倍，而Adss2仅呈现边际的1.3倍增加。相反，在BAT中，Adss1表达保持不变，而Adss2显示中度的1.5倍上调。类似地，经过14天的游泳训练后，iWAT中Adss1 mRNA水平显著升高，而Adss2仅轻微增加。在BAT中，两种同工酶在运动训练后均显示适度上调。这些转录变化在蛋白质水平得到进一步证实，在CL316243刺激和游泳训练条件下，iWAT中Adss1蛋白表达均显著上调。检查组织分布模式发现，Adss1表达主要定位于肌肉组织，而Adss2在各种组织中呈现更广泛的表达谱。值得注意的是，在脂肪细胞分化过程中，与Adss2相比，成熟米色脂肪细胞中Adss1表达显著增加。

为探索研究发现的临床相关性，分析了236名瘦和肥胖个体脂肪组织的RNA-seq数据。鉴于人类内脏脂肪组织（VAT）以高表达米色脂肪细胞标志基因和增强的线粒体氧化磷酸化为特征，分析聚焦于VAT。VAT中的ADSS1表达与涉及适应性产热和线粒体氧化磷酸化的基因显著相关。这些发现强烈表明，Adss1与脂肪组织中的产热过程密切相关，并可能在调节能量代谢中发挥关键作用。

2.2 Adss1^AKO小鼠刺激白色脂肪组织褐变和能量消耗

为研究Adss1在脂肪组织功能和全身代谢中的生理作用，利用脂联素-Cre小鼠构建了脂肪组织特异性Adss1敲除（Adss1^AKO）小鼠。通过qPCR和Western blot证实了Adss1在BAT、iWAT和附睾白色脂肪组织（eWAT）中的选择性缺失。在室温（RT）下饲喂普通饲料（CD）时，Adss1^AKO小鼠表现出脂肪量减少和脂肪库重量下降，尽管体重无显著差异。食物摄入量在两组间相当。值得注意的是，Adss1^AKO小鼠的iWAT呈现红色外观，组织学分析显示更小、多室的脂肪细胞。分子特征显示，Adss1^AKO小鼠在iWAT中激活了棕色/米色脂肪产热基因程序，表现为产热标志物（Ucp1、Cidea、Cox7a1和Cox8b）的上调，而脂肪细胞分化标志物Cebpa和Adipoq的表达保持不变。一致地，Adss1^AKO小鼠中Ucp1蛋白水平显著增加。重要的是，Adss1^AKO小鼠表现出葡萄糖耐量改善，而胰岛素敏感性呈现不显著但提示改善的趋势（P = 0.09），Adssl1敲低米色脂肪细胞中葡萄糖摄取基因（Slc2a1和Slc2a4）的表达保持不变。这些发现表明，脂肪组织特异性缺失Adss1促进了产热表型并增强了葡萄糖代谢，而不影响总体体重或胰岛素敏感性。

接下来评估了Adss1^AKO小鼠的耐寒性，通过在冷室中5°C下监测直肠温度。Adss1^AKO小鼠在冷暴露期间比对照小鼠更有效地维持核心体温。一致地，使用间接 calorimetry 检测到，冷暴露3天后，Adss1^AKO小鼠的产热、耗氧量（VO₂）和二氧化碳产生量（VCO₂）均高于对照小鼠。两组间呼吸交换比（RER）或身体活动未检测到明显改变。冷暴露下，Adss1^AKO小鼠iWAT中产热基因（包括Ucp1、Cox8b和Cidea）的表达增加，同时Ucp1蛋白水平升高。此外，一般脂肪生成标志物Cebpa、Adipoq和Fabp4的水平未见差异。H&E染色显示，与同窝对照相比，冷暴露3天后，Adss1^AKO小鼠iWAT中多室脂肪细胞的密度更高。此外，冷暴露7天后，Adss1^AKO小鼠维持了产热基因（如Ucp1和Cox8b）的高表达水平。另外，冷暴露下，Adss1^AKO小鼠的血清非酯化脂肪酸（NEFA）和甘油水平降低。

为表征转录组，对在RT下饲喂CD的对照和Adss1^AKO小鼠的iWAT进行了RNA测序。与对照小鼠相比，Adss1^AKO小鼠中共有74个基因显著上调，101个基因显著下调。值得注意的是，大多数与产热、氧化磷酸化和三羧酸（TCA）循环相关的基因均上调。基因本体分析进一步证实，Adss1^AKO iWAT中最富集的通路与产热和脂肪酸代谢相关。

鉴于在Adss1^AKO小鼠中观察到的能量消耗增加也可能归因于BAT活性增强，检查了这些小鼠BAT的产热和脂质代谢谱。值得注意的是，仅在急性冷挑战6小时后，观察到Adss1^AKO小鼠BAT中Ucp1蛋白水平显著上调。然而，在RT条件下和 prolonged 冷暴露下，棕色脂肪标志物（Ucp1和Cidea）和参与脂质代谢的基因表达保持不变。这些结果表明，Adss1^AKO小鼠能量消耗增强主要由促进iWAT褐变驱动。

2.3 Adss1调控米色和棕色脂肪细胞中的产热程序

为研究Adss1在调控产热程序中的细胞自主作用，在分化的成熟米色和棕色脂肪细胞中进行了功能获得和功能缺失研究。从Adss1^fl/fl小鼠分离iWAT和BAT的基质血管组分（SVFs）并分化为米色或棕色脂肪细胞。然后，用Cre重组酶腺病毒感染分化的脂肪细胞以沉默Adss1表达。Adss1敲低显著上调了米色脂肪细胞中产热标志物Ucp1的基因和蛋白水平，并且在异丙肾上腺素（ISO）刺激下进一步增加。这些效应并非由于增强的脂肪生成，因为从对照和Adss1^AKO小鼠分离的分化米色脂肪细胞在体外表现出相似的分化能力和相当的脂肪生成基因表达。此外，从Adss1^AKO小鼠分离的分化米色脂肪细胞也表现出增强的产热功能。一致地，在棕色脂肪细胞中Adss1敲低后观察到产热基因和蛋白质的类似变化。相反，沉默Adss2对产热程序没有影响。

为评估线粒体功能，使用Seahorse分析仪进行了细胞外通量分析。Adss1敲低显著增加了米色脂肪细胞的最大线粒体呼吸能力。然而，线粒体数量或线粒体DNA（mtDNA）含量没有差异，表明Adss1独立于线粒体丰度调节线粒体呼吸。与敲低结果相反，在米色脂肪细胞中过表达Adss1导致Ucp1抑制，而不影响脂肪细胞分化标志基因表达，并且也抑制了线粒体呼吸。在棕色脂肪细胞中过表达Adss1后，产热程序获得了类似的结果。

2.4 Adss1^AKO小鼠抵抗饮食诱导的肥胖和代谢紊乱

在确定条件性敲除Adss1增强CD喂养小鼠的全身能量消耗后，接下来检测了Adss1^AKO小鼠是否免受饮食诱导的肥胖。当用高脂饮食（HFD）挑战16周时，与同窝对照相比，Adss1^AKO小鼠体重增加更少，尽管两组食物摄入量相当。磁共振成像证实，Adss1^AKO小鼠与对照相比脂肪量减少，而瘦体重不受影响。此外，Adss1^AKO小鼠的iWAT、BAT和肝脏重量显著降低。与其瘦表型一致，Adss1^AKO小鼠与HFD喂养的对照相比，表现出血清瘦素降低、葡萄糖耐量改善和胰岛素敏感性增强。此外，经体重调整后，Adss1^AKO小鼠在β3-肾上腺素能刺激后表现出整体能量消耗、VO₂和VCO₂的显著增加，基础条件下观察到适度增加。RER和身体活动在两组间保持相当。这些发现提供了进一步证据，表明Adss1^AKO小鼠即使在代谢应激条件下也拥有增强的产热能力。

接下来检查了肝脏组织学，发现HFD喂养的Adss1^AKO小鼠肝脏脂质沉积减少。一致地，Adss1^AKO小鼠的肝脏TG以及血清AST、ALT和胆固醇水平均显著降低。在营养过剩条件下，过量的NEFA可能导致异位脂质沉积。值得注意的是，发现Adss1^AKO小鼠血清NEFA和甘油水平降低。为进一步研究Adss1敲低是否能减轻肥胖ob/ob小鼠的肝脏脂质沉积，将shAdss1-腺相关病毒（AAV）皮下注射到6周大ob/ob小鼠的iWAT中以诱导Adss1敲低。该干预导致肝脏TG水平显著降低，与肝脏组织学脂质沉积减少一致。此外，血清甘油水平显著降低，局部Adss1敲低的ob/ob小鼠中NEFA水平呈现下降趋势。更重要的是，ob/ob小鼠iWAT中Adss1敲低后，产热、脂肪酸合成和氧化相关基因的表达显著上调。

总之，这些发现表明Adss1缺失增强能量消耗并防止饮食诱导的肥胖。此外，在饮食诱导的肥胖小鼠和ob/ob小鼠中，Adss1缺失至少部分通过降低血清NEFA水平减轻了肝脏脂毒性。

2.5 Adss1缺失上调Gk表达并促进脂肪组织中的再酯化循环

除了其在脂肪组织能量调节中的作用外，Adss1缺失还在冷暴露和HFD条件下导致Adss1^AKO小鼠血清NEFA和甘油水平显著降低，促使进一步研究。为探索这一点，进一步测量了体内CL316243刺激后的血清NEFA和甘油水平。值得注意的是，Adss1^AKO小鼠在CL316243注射前呈现NEFA和甘油水平下降趋势，刺激后显著降低。在细胞水平，Adss1敲低同样在基础和异丙肾上腺素（ISO）刺激条件下降低了上清液中的NEFA和甘油浓度。这些发现提出了一个问题：减少的NEFA和甘油释放是源于脂解受损、再酯化增强还是脂肪酸氧化增加。

为解决这个问题，首先通过测量米色脂肪细胞中磷酸化激素敏感性脂肪酶（p-HSL）水平评估了脂解活性。值得注意的是，Adss1缺陷的脂肪细胞在ISO刺激下表现出p-HSL增加，表明降低的NEFA和甘油水平并非由于脂解受损。为识别潜在的替代机制，对来自Adss1^AKO小鼠的iWAT和原代Adss1敲低米色脂肪细胞进行了RNA测序。转录组分析揭示，两个实验系统中脂肪酸代谢通路显著上调。通过上调基因的交叉分析，识别出20个共同的差异表达基因，包括关键脂质代谢调节因子如Gk、Cpt1b、Elovl3、Acaa2和Fabp3。这些发现表明，NEFA和甘油释放的减少可能与增强的再酯化或脂肪酸氧化有关。值得注意的是，高达50%的脂解过程中释放的NEFA在脂肪细胞内再酯化为甘油三酯，突出了脂质通量的动态调节。Gk在WAT中几乎不表达，导致从甘油生成甘油-3-磷酸（G3P）可忽略不计。然而，它在BAT中高表达，并可在iWAT中由冷暴露强烈诱导。既往研究表明，iWAT中AAV介导的Gk敲低导致Ucp1表达显著降低。此外，Gk敲低降低了棕色脂肪细胞中的p-HSL水平。与这些发现一致，在米色脂肪细胞中使用siRNA敲低Gk也观察到Ucp1表达降低，而Gk过表达显著增强了Ucp1水平。此外，构建了脂肪组织特异性Gk敲除（Gk^AKO）小鼠，发现在冷暴露3天后，iWAT和BAT中的产热蛋白Ucp1以及调控产热和脂肪酸代谢的关键基因均减少。此外，据报道噻唑烷二酮（TZD）处理增强脂肪细胞中Gk表达，通过无效再酯化促进甘油掺入TG并减少NEFA释放。鉴于在Adss1^AKO小鼠中观察到的能量消耗增加和NEFA及甘油分泌减少，假设Gk作为介导Adss1代谢效应的关键下游效应器。

进一步证明，Adss1缺失显著上调米色脂肪细胞中的Gk表达。具体而言，在RT和冷刺激条件下，Adss1^AKO小鼠iWAT中Gk表达显著升高，而其他再酯化相关基因，如Pck1和Pck2，保持不变。类似地，在人脂肪细胞中，siRNA介导的ADSS1敲低也导致产热蛋白UCP1和GK显著上调。与此一致，米色脂肪细胞中Adss1敲低导致G3P水平增加。更重要的是，使用³H-甘油进行的同位素示踪显示，Adss1^AKO小鼠iWAT中的放射性信号更高，证实了Gk介导的甘油再酯化确实增强。除了再酯化，评估了脂肪酸氧化，发现通过Seahorse分析确定，米色脂肪细胞中Adss1敲低后棕榈酸氧化能力增加。此外，qPCR分析显示，冷暴露3天后，Adss1^AKO小鼠iWAT中参与脂肪酸合成和氧化的关键基因上调，包括Acaa2、Elovl3、Acadl、Acadm、Cpt1b和Hadh。这些发现表明，Adss1缺失通过促进甘油再酯化和随后的脂质氧化与合成增强脂质循环。

有趣的是，与同窝对照相比，衰老Adss1^AKO小鼠血清NEFA和甘油水平持续显著降低。同时，这些小鼠中Gk mRNA表达显著上调。鉴于NEFA是心肌细胞的主要能源，评估了老年小鼠的心脏功能。出乎意料的是，虽然舒张功能不受影响，但老年Adss1^AKO小鼠心脏收缩功能受损。一致地，参与脂肪酸氧化的基因表达，如Cpt1b和Acadm，在Adss1^AKO小鼠心肌中减少，表明这些小鼠心脏收缩功能受损可能归因于能量生产所需脂肪酸可用性有限。

这些发现表明，虽然Gk介导的代谢重塑增强年轻Adss1^AKO小鼠的能量消耗和脂质稳态，但老年小鼠循环NEFA的长期抑制可能损害心脏功能，突出了持续脂肪组织代谢适应的复杂生理后果。

2.6 Gk对于Adss1在脂肪中的功能不可或缺

为进一步研究在Adss1^AKO小鼠中观察到的代谢表型是否由Gk表达上调驱动，通过将Adss1杂合小鼠与Gk floxed小鼠杂交，构建了脂肪组织特异性Adss1和Gk双敲除小鼠（Adss1-Gk^AKO）。在RT条件下，发现Adss1^AKO小鼠iWAT中产热相关基因显著上调，这在Adss1-Gk^AKO小鼠中被逆转。类似地，在Adss1^AKO小鼠iWAT中观察到的产热蛋白Ucp1升高也在Adss1-Gk^AKO小鼠中被消除。与之前在Adss1^AKO小鼠中的结果一致，Adss1^AKO和Adss1-Gk^AKO小鼠BAT中产热蛋白Ucp1的表达保持不变。在10周龄时，将Adss1-Gk^AKO小鼠与其同窝对照和Adss1^AKO小鼠进行冷暴露以评估产热功能。研究发现，在Adss1^AKO小鼠中观察到的Ucp1蛋白水平上调以及产热基因（如Ucp1、Cidea、Cox8b和Cox7a1）表达增加，在Adss1-Gk^AKO小鼠中被消除。此外，Adss1^AKO小鼠iWAT的形态学褐变在Adss1-Gk^AKO小鼠中显著减弱，表明Gk在此过程中的关键作用。一致地，Adss1-Gk^AKO小鼠逆转了Adss1^AKO小鼠中增强的产热、VO₂和VCO₂，RER无显著差异。重要的是，脂肪组织中Gk的缺失有效防止了在Adss1^AKO小鼠中观察到的循环NEFA和甘油水平降低。与这些代谢变化一致，在Adss1^AKO小鼠中上调的参与脂肪酸合成（Acaca、Fasn）和氧化（Acaa2、Cpt1b、Hadh）的基因在Adss1-Gk^AKO小鼠中显著减弱。

为确定iWAT中靶向Gk抑制是否能逆转Adss1^AKO小鼠的代谢改变，将AAV-Gk局部注射到对照和Adss1^AKO小鼠的iWAT中以降低Gk表达。注射后四周，将小鼠在寒冷条件下单独饲养三天。正如预期，Gk敲低有效逆转了Adss1^AKO小鼠中的循环NEFA和甘油水平，并消除了Ucp1蛋白的上调。这些发现证实，iWAT中Gk耗竭足以调节Adss1^AKO小鼠的表型。总之，结果确定Gk作为Adss1的关键下游效应器，驱动其对脂肪组织脂质循环和产热适应的调节影响。

2.7 Adss1缺失选择性重塑Gk的组蛋白乙酰化

研究发现脂肪组织中的Adss1蛋白定位于细胞质，与既往研究一致。鉴于这种胞质定位，研究了Adss1是否通过调节胞质嘌呤核苷酸浓度影响Gk表达。既往研究表明，IMP在调节产热基因表达和促进iWAT褐变中发挥作用。由于IMP是Adss1的直接上游产物，假设Adss1敲低可能导致其积累。为测试这一点，量化了缺乏Adss1的米色脂肪细胞中的嘌呤核苷酸水平。然而，靶向代谢组学分析显示IMP水平无显著变化，或其下游产物S-AMP也无变化。嘌呤核苷酸，特别是AMP/ATP和ADP/ATP比率，已知通过AMPK通路调节能量代谢。分析显示AMP/ATP或ADP/ATP比率无统计学显著变化，单个核苷酸水平也无变化。此外，利用Cre重组酶耗竭来自AMPK-floxed小鼠的米色脂肪细胞中的AMPK，结合慢病毒介导的Adss1敲低。值得注意的是，即使在没有AMPK的情况下，Adss1沉默后观察到的Ucp1表达增加仍然持续，表明Adss1介导的脂肪细胞功能改变独立于AMPK通路发生。

为进一步阐明Adss1介导效应的机制，用来自Adss1^AKO小鼠iWAT和Adss1缺陷米色脂肪细胞中前150个上调基因查询了CMap数据库。基于其富集分数对化合物进行排名并在2D图中可视化。有趣的是，位于第一象限的化合物（用红点标记）在两个数据集中均显示正富集，提示与Adss1缺陷功能相似。其中，HDAC抑制剂（HDAC3选择性）和组胺受体拮抗剂获得异常高分（>99），表明与Adss1缺陷诱导的转录谱高度一致。鉴于HDAC在脂肪组织生物学中已确立的作用，这一点尤其值得注意。HDAC通过组蛋白乙酰化调节基因表达，特异性抑制HDAC可增强脂肪组织中的产热功能。值得注意的是，据报道脂肪组织特异性缺失HDAC3可诱导iWAT褐变并增强无效脂质循环，进一步支持了HDAC抑制与Adss1缺陷观察效应之间潜在的功能联系。因此，首先检测了Adss1缺陷米色脂肪细胞中的HDAC活性。正如预期，观察到HDAC活性显著降低。同时，Hdac1、Hdac2和Hdac3 mRNA表达无变化。随后，进行了靶向代谢组学分析以评估据报道调节HDAC活性的细胞内代谢中间体水平，包括乙酰-CoA、CoA、丁酸和β-羟基丁酸，组间未发现显著差异。为进一步阐明Adss1缺陷降低HDAC活性的机制，研究了Adss1与HDAC的功能相互作用。在米色脂肪细胞中，发现内源性Adss1与HDAC3相互作用，当过表达Flag-Adss1时也证实了类似的关联。值得注意的是，Adss1缺失改变了HDAC3的亚细胞分布，导致核积累减少和伴随的胞质滞留。这些发现指出了Adss1在控制HDAC3动力学中的作用，并提示了对组蛋白乙酰化的潜在后果。

H3K27乙酰化是产热基因激活的关键组蛋白标记，因此检测了其在Adss1缺陷米色脂肪细胞中的水平。酸提取的组蛋白显示，与对照相比，Adss1缺陷显著增加了米色脂肪细胞中的H3K27ac。相反，其他组蛋白修饰——包括H3K9ac、H3K4me3和H3K27me3——未显示显著变化。这些发现表明，Adss1缺失选择性升高H3K27ac，可能促进产热转录程序。与此概念一致，对已发表的H3K27ac ChIP-seq数据（GSE108077）的分析显示，冷暴露可显著增强iWAT中Gk启动子处的H3K27ac富集。这提示了一种表观遗传机制，即寒冷条件下Gk位点增加的H3K27ac促进Gk转录激活，有助于褐变过程中的脂肪组织重塑。重要的是，使用H3K27ac抗体的染色质免疫沉淀（ChIP）分析证实，在Adss1敲低成熟米色脂肪细胞中，Gk启动子处的H3K27乙酰化增加，而Ucp1启动子和增强子区域的H3K27乙酰化水平保持不变。这些结果表明，Adss1缺失选择性增强Gk启动子处的H3K27乙酰化，提供了Adss1与Gk转录调控之间的机制联系。

2.8 人脂肪组织ADSS1与代谢特征相关

为研究ADSS1在肥胖中的临床相关性，分析了瘦、超重和肥胖个体的脂肪组织样本。VAT和SAT中的ADSS1 mRNA表达与BMI和体脂百分比呈显著负相关，而ADSS2未观察到显著相关性。值得注意的是，VAT和SAT中的ADSS1表达也与HOMA-IR和HbA1c负相关。此外，ADSS1表达与肝脏疾病标志物（包括AST和ALT）负相关。肝脏脂质沉积的关键指标FLI也与VAT和SAT中的ADSS1表达负相关。相反，ADSS2与这些临床参数无显著相关性。总之，这些发现强烈表明，在人脂肪组织中，ADSS1可能在肥胖及其相关代谢功能障碍的发病机制中起因果作用。

3 讨论

本研究揭示了Adss1在调节脂肪组织稳态中先前未被认识的作用，拓宽了对嘌呤核苷酸合成酶对能量代谢贡献的洞察。研究发现表明，Adss1^AKO小鼠在RT条件下表现出明显的iWAT褐变。冷暴露下，Adss1^AKO小鼠显示能量消耗增加，能够更有效地维持核心体温。此外，这些小鼠表现出对饮食诱导肥胖的抵抗，以及改善的葡萄糖耐量、增强的胰岛素敏感性和减少的肝脏脂质积累。

既往研究很大程度上低估了嘌呤核苷酸合酶在脂肪产热中的作用，主要由于冷刺激后BAT中观察到的变化极小。然而，研究揭示，响应冷暴露、β-肾上腺素能刺激和体育锻炼，iWAT中Adss1强烈上调，提示Adss1和适应性产热反应先前未被认识的作用。这种表达模式让人联想到其他基因，如Pwwp2b、Kcnk3和5′-截短的腺苷酸环化酶3 mRNA异构体（Adcy3-at），据报道在类似条件下脂肪组织中显著上调。然而，这些基因作为产热的负调节因子，其缺失增强