INSL3作为公猪免疫去势关键生物标志物：Leydig细胞转录调控机制与临床应用前景

《Andrology》：INSL3 Expression in Leydig Cells is a Biomarker for Immunocastration in Boars: Transcriptional Evidence

本文系统探讨了不同免疫去势方案对青春期公猪睾丸功能的差异化影响，通过多组学分析首次确立INSL3 mRNA表达作为评估免疫去势效果的关键生物标志物。研究通过比较不同时间间隔（4/8/12周）的疫苗接种方案，结合睾丸组织形态学、激素水平检测和基因表达谱分析，揭示了GnRH免疫抑制后Leydig细胞功能恢复的分子机制，为优化畜禽福利化去势技术提供重要理论依据。

　　

1 引言

免疫去势通过主动免疫抑制促性腺激素释放激素（GnRH）实现雄激素剥夺，自2009年在欧盟获批作为猪仔外科去势的替代方案。该技术通过初次接种和加强免疫触发抗GnRH抗体产生，阻断下丘脑-垂体-性腺轴，在加强接种后2-4周内抑制睾丸功能。标准免疫方案通常在青春期前（8-12周龄）进行初次接种，在标准屠宰体重前4-6周进行加强免疫。虽然推荐方案有效率高达95.7%，但对于屠宰体重更大、年龄更高的猪群，或因公猪膻味风险较高而不适合饲养完整公猪的生产体系，仍需探索替代免疫方案。

2 方法

2.1 实验设计与动物处理

研究采用商业猪场的大型白猪×长白猪杂交后代，设置四个实验组：完整公猪组（EM，n=6）和三个免疫去势组（IC，每组n=6）。免疫组分别采用早期、中期和晚期加强方案（加强接种至屠宰间隔分别为12、8和4周）。所有猪只在32.5周龄（体重152±14 kg）于商业屠宰场采样，屠宰前禁食16小时，采用CO₂致昏和立式放血处理。

2.2 采样与测量

屠宰时采集血液用于抗体效价和睾酮浓度分析，记录热胴体重并解剖生殖道。计算生殖道指数（GTI）、睾丸指数（TI）、精囊腺指数（VGI）和尿道球腺指数（BGI）。取睾丸实质样品进行组织学分析和mRNA表达检测，采用国际照明委员会（CIE）Lab*色度系统评估睾丸组织颜色，采集皮下脂肪样品用于公猪膻味化合物分析。

2.3 组织学分析

睾丸样品经Bouin液固定后石蜡包埋，制备5μm切片进行H&E染色。使用成像软件测量至少100个Leydig细胞及其核面积，计算核质比（N:C ratio）。

2.4 化学分析

采用固相碘化法测定GnRH抗体结合率，直接放射免疫分析法测定血浆总睾酮浓度，高效液相色谱法（HPLC）测定脂肪中雄烯酮浓度。

2.5 基因表达分析

使用RNeasy Mini Kit提取睾丸组织总RNA，通过定量PCR（qPCR）分析ESR1、ESR2、FSHR、LHCGR、INHBA、INHA、GNRHR-II、AR、STAR、HSD17β7、BHMT、INSL3、CRHR1和PDGFRα等基因表达。以β-2-微球蛋白（B-2-M）和18S rRNA作为内参基因，采用2^?ΔΔCt方法计算相对表达量。

2.6 统计分析

使用R软件进行主成分分析（PCA）和层次聚类分析，采用Wilcoxon秩和检验比较组间差异，设定fold change > 1.5且p < 0.05为显著差异标准。

3 结果

3.1 生殖器官与激素水平

所有免疫组均产生GnRH抗体反应（p < 0.004）。IC-4组睾酮浓度显著低于EM组（p = 0.041），IC-8和IC-12组呈中间值。脂肪雄烯酮浓度在IC-4组有降低趋势（p = 0.067）。IC-4组Leydig细胞核质比显著高于EM组（p = 0.033），表明细胞萎缩。

3.2 睾丸组织学

EM组显示正常睾丸实质结构，而IC-4组呈现雄激素缺乏特征：生精细胞退化、生精上皮空泡化和Leydig细胞萎缩。IC-8和IC-12组萎缩程度较轻，与睾酮水平恢复一致。

3.3 基因表达谱

层次聚类将免疫猪分为低睾酮组（IC-LT，中位数0.56 ng/mL）和高睾酮组（IC-HT，中位数7.04 ng/mL）。IC-LT组FSHR和ESR2表达较高，而LHCGR、STAR和INSL3表达较低。ESR1和HSD17β7在两组IC中均低于EM组。

3.4 Leydig细胞标志物验证

INSL3表达在所有低睾酮免疫组（YIC-LT和MIC-LT）中均显著降低，与睾酮水平和睾丸形态参数高度相关。PDGFRα表达仅在年轻免疫猪中显示差异。

3.5 相关性分析

INSL3、STAR和LHCGR表达与多数研究变量强相关。INSL3与睾酮浓度、生殖器官指数正相关，与GnRH抗体结合率、睾丸亮度和Leydig细胞核质比负相关。

4 讨论

免疫去势在青年猪中效果显著，但青春期公猪反应存在个体差异。睾丸功能在GnRH抑制后4周达到最低点，部分个体在8-12周后出现功能恢复，可能与LHCGR表达差异有关。研究表明，GnRH抗体结合率>40%、血浆睾酮<1 ng/mL、GTI<0.45、TI<0.55或Leydig细胞核质比>0.30可作为雄激素缺乏的有效指标。

INSL3作为Leydig细胞功能标志物，其表达水平与睾丸功能参数高度一致，且不受年龄波动影响，具备成为可靠生物标志物的潜力。与睾酮相比，INSL3在青春期后保持稳定，更适合长期监测。

5 结论

免疫去势效果受接种时机和个体差异影响，加强接种后4周睾丸功能抑制最显著。INSL3 mRNA表达是评估免疫去势效果的可靠生物标志物，其稳定性和特异性为临床监测提供了新方案。未来需建立公猪INSL3的阈值标准和参考范围，以推进该技术在畜禽生产中的规范化应用。