斑马鱼发育性癫痫性脑病模型精准再现临床脑电图生物标志物的研究

《Epilepsia》：Zebrafish models of developmental epileptic encephalopathy accurately reflect clinical electrographic biomarkers

本文通过分析六种基因工程斑马鱼模型的局部场电位记录，证实了斑马鱼能够重现人类发育性癫痫性脑病（DEE）中常见的高频振荡（HFO）、频谱功率改变和发作间期癫痫样放电（IED）等电生理生物标志物，为斑马鱼作为转化相关性癫痫模型提供了有力证据。

　　

摘要

发育性癫痫性脑病（DEE）是以严重性和治疗挑战性为特征的癫痫病症。脑电图（EEG）的频谱成分可能为癫痫严重程度提供有价值的生物标志物。这些信号特征包括功率谱密度改变、发作间期癫痫样放电（IED）和高频振荡（HFO）。这些发现主要来源于颞叶癫痫患者和啮齿类动物模型。在临床前DEE模型中，关于改变的频谱EEG成分的证据很少。本研究分析了模拟人类DEE条件的基因工程斑马鱼的电生理学数据。

1 引言

癫痫是一种以异常脑活动为特征的神经系统疾病，是全球近6500万人的主要健康问题。癫痫表型的诊断依赖于脑电图（EEG）对这种活动的检测。通过分析这些电生理记录，临床医生已经确定了与癫痫发作倾向相关的几种异常，包括发作间期癫痫样放电（IED）、棘慢波放电和高频振荡（HFO）。在癫痫病症谱系中，发育性癫痫性脑病（DEE）是一种严重的诊断，始于生命早期，很少能被抗癫痫药物良好控制，并且通常由从头单基因功能丧失（LOF）突变引起。虽然基因修饰的啮齿类模型可以模拟临床DEE表型，但为大量单基因突变创建这些模型费力且缓慢，凸显了对高通量临床前动物模型的需求。斑马鱼（Danio rerio）提供了这样一种替代方案。作为一种小型、基因易操作且成本效益高的脊椎动物，斑马鱼被广泛用于神经科学领域，以分析人类疾病基因的同源物并研究它们对脑功能的影响。

本研究使用了六种先前被归类为癫痫的基因修饰斑马鱼系、一个包含数千个宽频带无间隙局部场电位（LFP）记录的数据库以及基于MATLAB的软件，来定量评估与DEE相关的异常脑活动。使用先前在人类和啮齿类动物中验证过的方法分析LFP中HFO的存在。

2 材料与方法

2.1 斑马鱼饲养

所有程序遵循《动物护理和使用指南》，并获得了加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（AN201489-00E）的批准。斑马鱼突变系通过CRISPR-Cas9编辑或N-乙基-N-亚硝基脲诱变在Tupfel Long-Fin背景上产生。LFP数据在受精后5至6天（5–6 dpf）收集。

2.2 电生理学

在2010年至2022年间，收集了斑马鱼幼虫宽频带LFP记录的电生理学数据库。所有记录均在一致条件下进行，使用随机选择的幼虫（来自100-200只幼虫的窝）和随机选择的成年繁殖对。简要来说，斑马鱼幼虫被背侧向上固定在2%低熔点琼脂糖中，置于室温下的切片灌注室内。使用单个硼硅酸盐玻璃微电极在中脑记录LFP。宽频带LFP信号在放大器上进行滤波，采样频率设置为10 kHz，并作为编码文件存储在运行AxoScope 10.3软件的Windows计算机上。

2.3 高频振荡

高频振荡（HFO）定义为>250 Hz的振荡。在视觉筛查HFO后，使用MATLAB中的RippleLab以及Staba等人的算法进行自动检测，随后进行进一步的视觉确认。LFP信号使用有限脉冲响应滤波器在250和500 Hz之间进行带通滤波，并测量均方根（RMS）振幅。如果候选HFO在整流后的带通信号中至少有四个峰值超过基线5个标准差且持续时间大于6毫秒，则将其分类为HFO。与运动伪影或背景噪声相关的频谱图活动被排除。

2.4 发作间期癫痫样放电

发作间期癫痫样放电（IED）定义为在自发性发作性发作事件之间观察到的短暂阵发性电图片放电。在视觉筛查发作样（II型）事件后，选择发作后抑制后的前一对IED和下一次发作事件开始前的最后一对IED进行分析。包括间隔>30秒的自发性反复发作事件。计算IED的峰峰值间隔（秒）和振幅（微伏）。

2.5 统计分析

数据报告为平均值±标准误。统计显著性定义为p< .005。所有统计分析均在Prism中进行。使用未配对或配对双尾Student t检验比较两组参数数据。使用GraphPad中的D'Agostino-Pearson检验评估正态性，而Brown–Forsythe检验评估方差同质性。

2.6 数据收集和报告

所有研究均严格按照美国癫痫协会/国际抗癫痫联盟转化工作组描述的临床前癫痫研究通用数据元素指南进行。

3 结果

3.1 DEE斑马鱼突变体

本文介绍的六种DEE斑马鱼系与神经发育（ARX和STRADA）、突触后受体功能（GABRB3和GRIN1B）、电压门控钠通道功能（SCN1A）和代谢（PNPO）相关。使用在线单细胞基因表达转录组数据库确认了神经基因表达。所有六种DEE基因在神经特异性基因簇中的差异表达水平比所有其他簇的平均表达水平高2-6倍。这些数据证实了DEE基因在发育中斑马鱼的大脑特异性表达。

3.2 实验设计

对EEG数据的分析提供了预测和量化神经系统疾病（如自闭症谱系障碍、注意力缺陷/多动障碍、阿尔茨海默病和癫痫）严重程度的潜力。我们的前期工作描述了模拟人类DEE群体中观察到的LOF突变的基因修饰斑马鱼系。选择其中六个斑马鱼系进行详细的信号处理分析，因为识别癫痫临床EEG生物标志物的努力主要集中在频谱特征上。工作流程包括盲法LFP数据采集、随后的无偏倚LFP特征提取，然后进行文件解码和数据呈现。建立了LFP轨迹中的主导频率、HFO和IED并进行了量化。

3.3 快速傅里叶变换

为了研究斑马鱼DEE模型中的LFP是否表现出不同的频谱特征，我们分析了突变体和野生型（WT）同胞斑马鱼的记录。对野生型（n= 31）和表现出II型发作活动的癫痫突变斑马鱼系——arxa^?/?（n= 7）、gabrb3^?/?（n= 16）、grin1b^+/?（n= 6）、pnpo^?/?（n= 7）、scn1lab^?/?（n= 23）和strada^?/?（n= 5）——进行了快速傅里叶变换（FFT）分析。野生型斑马鱼在低频范围（0.1–5 Hz）显示出有限的功率，与arxa、pnpo和strada突变体相似。FFT图的比较表明，gabrb3、grin1b和scn1lab突变体的LFP记录中频谱功率更高。这些差异在delta频率范围（0.5–3.5 Hz）内最为显著。这些发现让人联想到Gabrb3基因敲除小鼠和Dravet（SCN1A）综合征患者EEG记录中增强的delta功率的报告。

3.4 高频振荡

人们普遍认为，频率在30至600 Hz之间的HFO可以预测癫痫发作严重程度并定位癫痫发作起始区。病理性HFO已在人类和啮齿类颞叶癫痫（TLE）模型的记录中被识别。然而，人们对遗传性癫痫病症中HFO的发生了解不多。为了识别HFO，分析了野生型（n= 31）和六种突变斑马鱼系（n= 64）的LFP记录。对于每个文件，视觉检查宽频带LFP记录以识别频率是背景3倍的高频发作样活动。然后使用自动化方法，在MATLAB中使用RippleLab代码检测候选HFO。该方法通过应用带通滤波器分析80至500 Hz之间的LFP片段，随后计算RMS以检测振幅高于RMS信号平均振幅5倍以上且持续时间超过6毫秒的候选HFO事件。自动检测之后进行视觉检查以及人类和啮齿类动物研究中描述的纳入/排除标准。斑马鱼LFP中的HFO（定义为大于250 Hz的自发性振荡）在scn1lab和gabrb3突变系中最频繁；野生型文件中不包含HFO事件。根据与人类EEG的比较以及三个图像（未滤波LFP原始轨迹、滤波LFP轨迹和时频图）的分析，单个事件被分类为“带棘波的HFO”。使用这些标准，在所有六种斑马鱼模型中识别出自发发生的HFO。重要的是，这是首次在代表不同遗传起源的DEE条件的六种不同斑马鱼系中报告这些标志性事件的研究。

3.5 发作间期癫痫样放电

发作间期癫痫样放电（IED）是在自发性癫痫发作事件之间观察到的短暂阵发性电图片放电。IED和癫痫发作密切相关，在啮齿类模型和癫痫患者中都观察到了动态变化。我们分析了来自包含反复发作事件活动的随机选择文件的总共122个IED事件（n= 61 野生型，n= 61 突变体）。发作后抑制后的前两个IED之间的间隔短于下一次发作事件前的最后两个IED之间的间隔，并且第一个抑制后IED的振幅比最后一个发作前IED增加。显示了所有六种DEE斑马鱼系LFP记录的累积数据。接下来，我们计算了每个单独DEE斑马鱼系的平均百分比变化。注意到IED间隔一致减少，同时IED振幅增加。

4 讨论

本研究的主要结果如下：（1）对斑马鱼幼虫DEE模型中记录的高带宽LFP进行自动分析，确定了HFO的存在；（2）FFT分析显示，gabrb3、grin1b和scn1lab突变体在delta频率范围（0.5–3.5 Hz）内的LFP记录中频谱功率增加；（3）观察到的IED动态变化与癫痫发生过程的特征一致。未来研究利用表达基因编码神经元钙指示剂的透明转基因斑马鱼和快速三维全脑成像技术的独特优势，可能为了解产生这些事件的网络提供有价值的见解。

场电位记录中的HFO被认为是癫痫网络事件，有助于指导癫痫手术。临床前研究也在啮齿类TLE模型的海马中识别出了病理性HFO。类似地，本研究中在斑马鱼中观察到的HFO事件可能被证明在评估新型突变体的癫痫严重程度或作为新抗癫痫治疗疗效的临床前测量指标方面有用。然而，值得注意的是，与TLE模型不同，HFO活动在这些癫痫斑马鱼中并不伴随 prolonged seizure 或 significant neuronal loss。尽管认为HFO反映了高阶海马或新皮质神经元中的协调活动，但这些动物模型数据表明，这种集合可以在没有更高大脑结构的更简单神经系统中出现，并且出现在遗传性而非获得性癫痫病症中。

在delta（0.5–4 Hz）频带的EEG慢波已在正常和神经系统条件下（如昏迷、创伤性脑损伤或癫痫）中被观察到。据信，EEG慢波反映了两种相反水平皮层活动之间的交替：强直性放电（上升状态）和超极化静默期（下降状态）。γ-氨基丁酸能抑制已被提出作为下降状态的机制。在本研究中，在与抑制性功能障碍相关的两种遗传性DEE遗传条件（特别是SCN1A和GABRB3）中观察到增加的慢波活动。这一观察结果与抑制性突触传递的作用一致，并与类似的报告相匹配。

IED也传统上用于癫痫诊断。这些事件的动态被认为反映了网络中潜在的病理性紊乱。在TLE患者的EEG信号中已经注意到了IED振幅或频率的变化。在匹鲁卡品大鼠TLE模型中，当自发性癫痫发作复发时，发作间期放电的频率变得更加频繁。这些跨物种的发现表明，IED活动的改变可能是癫痫病症的一个保守特征。然而，由于IED在多大程度上指示癫痫大脑仍不确定，我们在一个能够进行高通量研究的实验模型中的观察可能为这个问题提供有价值的见解。

总之，在癫痫斑马鱼中一致观察到了增强的低频活动、典型的癫痫源性IED模式和HFO事件。经常有人指出，斑马鱼模型在表型复制复杂人脑环境和癫痫网络方面存在局限性。然而，我们的结果表明，通过采用临床使用的计算工具，在人类中观察到的电图片特征可能对应于一个进化上保守的脑功能。尽管先前的研究主要检查了斑马鱼模型中发作间期或发作样电事件的存在，但本研究集中于LFP记录中更复杂的电图片模式。我们的方法确认并扩展了早期结合MATLAB程序进行斑马鱼幼虫复杂放电自动检测或功率谱密度分析的计算研究。在具有数十亿神经元的神经系统中识别负责HFO的网络仍然是一个关键但具有挑战性的临床问题。通过利用模拟DEE的斑马鱼幼虫模型，我们明确地确立了临床上看到的电图片事件存在于一个仅有大约10万个神经元的幼虫大脑中，这可能为评估潜在网络提供一个实验平台。