间充质干细胞与星形胶质细胞来源的混合细胞外囊泡：一种靶向神经退行性疾病应用的多功能纳米治疗新策略

《Journal of Extracellular Vesicles》：Hybrid Extracellular Vesicles With Combined Functional Properties From Mesenchymal Stem Cells and Astrocytes for Targeted Neurodegenerative Disease Applications

本文报道了一种通过膜融合技术构建新型混合细胞外囊泡（hEVs）的创新平台，该囊泡结合了胎盘来源间充质干细胞（PMSC）与星形胶质细胞（Astrocyte）来源EVs的独特功能特性。研究通过超分辨率显微镜、定量蛋白质组学等功能表征，证实hEVs在脑细胞靶向、神经保护和免疫调节方面展现出协同优势，为开发针对复杂病理（如神经退行性疾病）的多功能EV疗法提供了新思路。

　　

混合细胞外囊泡在神经退行性疾病治疗中的应用研究

1 引言

细胞外囊泡（EVs）是一类直径约30至1000纳米的膜性囊泡，几乎由所有细胞类型分泌。它们通过细胞表面结合事件或细胞内容易位及生物活性货物的运输，触发特定过程和信号事件。近年来，EVs作为纳米治疗剂和药物递送系统在多种疾病适应症中受到广泛研究。然而，由于EVs的物理异质性和功能效力的差异，其转化应用面临挑战。神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病，具有复杂的疾病生物学特征，需要多方面的治疗方法，而目前的治疗策略有限。间充质干细胞（MSCs）及其衍生物，包括EVs，已被证明在调节许多疾病相关过程和通路方面有效，如神经元生长和免疫调节。目前，有几项I/II期临床试验正在评估来自不同组织来源的MSCs以及MSC衍生EVs的安全性和有效性。然而，单个EV来源缺乏全面治疗所需的全套治疗特性。干细胞衍生的EVs具有一般的神经保护和抗炎作用，但缺乏广泛的血脑屏障穿透性和特定的神经退行性病理靶向性。星形胶质细胞独特地参与关键的神经元过程，但在疾病状态下容易呈现神经炎症表型。因此，本研究旨在通过膜融合技术，将PMSC衍生的EVs与星形胶质细胞衍生的EVs融合，生成一种新型的混合EV制剂，并确定其物理化学和功能特性，以解决神经退行性疾病治疗中的关键挑战。

2 方法

2.1 PMSC和星形胶质细胞培养

本研究使用人PMSCs和人星形胶质细胞进行EVs的生产和分离。PMSCs先前通过外植体培养从去标识的丢弃的人类妊娠中期胎盘的绒毛膜组织中分离得到。早期传代P2 PMSCs在杜尔贝科改良 Eagle 培养基高糖（DMEM）中培养，培养基补充有5%胎牛血清（FBS）、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）和1%青霉素/链霉素（P/S）。经机构审查委员会批准的原代人星形胶质细胞（Gibco）在DMEM中培养，培养基补充有5% FBS和1% N-2补充剂。两种细胞类型均在37°C、5% CO₂条件下的T150培养瓶（Corning Inc）中培养。

2.2 PMSC EV和星形胶质细胞EV分离

PMSC EVs和星形胶质细胞EVs分别按照先前描述的方案进行分离。简言之，使用L7超速离心机（Beckman Coulter）和SW28转子，在4°C下以112,700 × g离心16小时，以耗尽外源性EVs。收集上清液并储存于-20°C，作为EV耗尽的FBS。第4代的PMSCs和星形胶质细胞以20,000 cells/cm²的密度接种在总面积为875 cm²的5层培养瓶（Corning Inc）中，培养基含有5% EV耗尽的FBS、20 ng/mL FGF、20 ng/mL EGF和1% P/S，在37°C、5% CO₂条件下培养48小时。收集条件培养基，在4°C下以500 × g离心10分钟，并使用0.22 μm过滤器真空过滤。通过差速离心分离EVs。条件培养基在4°C下以8812 × g离心30分钟。上清液通过0.22 μm过滤器过滤，并在4°C下以112,700 × g离心90分钟。弃去上清液，将沉淀用PBS洗涤，然后在4°C下以112,700 × g再次离心90分钟。最后离心步骤后，将EV沉淀重悬于每5层培养瓶使用的100 μL三重过滤PBS中。取等分EVs立即通过NTA测量浓度，其余储存于-80°C。

2.3 混合EVs的合成

分离PMSC EVs和星形胶质细胞EVs后，通过挤出或浴超声处理合成混合EVs。对于挤出法，使用迷你挤出器（Avanti Polar Lipids）和一系列孔径膜过滤器（Whatman filter, Millipore Sigma）。通过改变膜过滤器孔径（0.1 μm、0.2 μm、0.4 μm）、PMSC EVs与星形胶质细胞EVs的比例（10:1、2:1、1:1、1:2、1:10）、通过迷你挤出器的次数（5、10、15次）和EV浓度（1 × 10¹⁰ EVs/mL、1 × 10¹¹ EVs/mL、1 × 10¹² EVs/mL）来优化膜融合。将200 μL PMSC EV和星形胶质细胞EV混合物吸入玻璃注射器，通过膜过滤器，然后在冰上静置15分钟。对于浴超声处理，使用Elmasonic超声波清洗设备（Elma Ultrasonic Cleaners）。通过改变超声处理时间（30秒、1分钟、3分钟）、浴超声处理轮数（1、2、3）、PMSC EVs与星形胶质细胞EVs的比例（10:1、2:1、1:1、1:2、1:10）和EV浓度（1 × 10¹⁰ EVs/mL、1 × 10¹¹ EVs/mL、1 × 10¹² EVs/mL）来优化膜融合。将200 μL混合的PMSC EVs和星形胶质细胞EVs加入0.5 mL Eppendorf管（Corning Inc）中，置于浴超声器中的漂浮管架上，然后在冰上静置15分钟。通过挤出或超声处理合成混合EVs后，立即通过NTA测量EV样品，然后等分并冷冻于-80°C。

2.4 通过NTA表征EVs

进行NTA以量化EV产量和尺寸分布。使用ZetaView x30下一代纳米粒子分析仪（Particle Metrix）表征PMSC EVs、星形胶质细胞EVs和合成的混合EV制剂。将EVs在4 mL超纯水（Gibco）中稀释2000倍，并注入NTA中。在22°C下收集尺寸和Zeta电位测量值。

2.5 通过Western Blot表征EVs

通过Western blotting分析可视化EV相关蛋白。简言之，将EVs用NuPAGE LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific）处理，并加热至90°C。运行样品，转移，用1:500稀释的一抗探测，包括Alg-2相互作用蛋白X（ALIX；兔多克隆，Millipore Sigma）、肿瘤易感基因（TSG101；克隆T5701；Millipore Sigma）、CD9（克隆MM2-57；Millipore Sigma）、钙联接蛋白（克隆C5C9；Cell Signalling Technology）和CD63（克隆TS63；Thermo Fisher Scientific）。在使用ALIX、钙联接蛋白和TSG101抗体的样品孔中，样品用还原剂二硫苏糖醇（DTT）制备。在用CD63和CD9抗体染色的样品孔中未使用DTT。然后使用相应的二抗探测印迹，并使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad, Hercules）显影。

2.6 EVs的冷冻电子显微镜检查

使用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）直接观察PMSC EVs、星形胶质细胞EVs和混合EV制剂。为制备EV样品用于cryo-TEM，将铜网（200目，1.2 μm孔；Ted Pella Inc）在25 mA下辉光放电30秒。将4 μL EVs等分试样应用于网的碳侧，在湿度室中吸干5秒，孵育30秒，并在EM GP2自动 plunge冷冻仪（Leica Microsystems）中 plunge冷冻到预冷液乙烷中。此过程导致EV样品在非晶冰薄层中玻璃化，以保持其天然状态并保护其在成像过程中免受辐射损伤。然后使用Glacios 2电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）对样品进行成像，该显微镜配备有自动进样器，加速电压为200 kV，用于高分辨率网格筛选和数据收集。使用GATAN K3直接电子探测器在11000×和45000×放大倍数下获取图像，离焦值介于-2 μm和-5 μm之间。每张图像的总累积剂量不超过40 e/?²。

2.7 EVs的超分辨率显微镜检查

使用单分子定位显微镜获取PMSC EVs、星形胶质细胞EVs和混合EV制剂的超分辨率图像，用于分析表面标志物表达和量化膜融合效率。使用温度控制的Nanoimager S Mark II显微镜（Oxford Nanoimaging）进行单个EV的直接随机光学重建显微镜（dSTORM）检查，该显微镜配备有100X、1.4NA油浸物镜。按照制造商的说明使用EV Profiler Kit（版本1；Oxford Nanoimaging）。使用试剂盒中的CD9-AlexaFluor 488、CD63-AlexaFluor 568和CD81-AlexaFluor647抗体进行EV样品的表面标志物分析。为了量化膜融合效率，在混合EV合成之前独立荧光标记PMSC EVs和星形胶质细胞EVs。使用亲脂性碳菁染料DiD（Thermo Fisher Scientific）标记PMSC EV膜，使用DiO（Thermo Fisher Scientific）标记星形胶质细胞EV膜，浓度为1 μM。将EV样品和染料在Eppendorf管中混合，并在37°C平板摇床上孵育30分钟。孵育后，分别过滤PMSC EVs和星形胶质细胞EVs以去除游离染料。将全部体积转移到30 kDa截留分子量的Nanosep过滤器（Omega膜；Pall Corporation），并在4°C下以7000 g离心10分钟。通过用过滤PBS轻轻重悬从聚醚砜膜上回收过滤的混合EVs，并用于EV Profiler Kit。在Nanoimager上的图像采集在全内反射荧光（TIRF）模式下进行，照明角度为54°。每次使用显微镜时校准激光功率以及通道映射校准，以对齐通道数据，计算点扩散函数的标准偏差最大为10 nm。使用NimOS软件（v1.19.7；Oxford Nanoimaging）获取每个通道1000帧数据，曝光时间为30毫秒（总共3000帧）。将原始定位图像上传到CODI进行云存储和自动图像分析。简言之，对定位图像进行漂移校正，通过光子计数和精度过滤，聚类，并计数用于群体统计和相对荧光团丰度分析。膜融合效率通过将双阳性DiD/DiO⁺⁺簇的数量除以检测到的总簇数来计算，其中阳性定义为簇内具有三个或更多定位。

2.8 EV制剂的蛋白质组学分析

使用EasyPep MS样品制备试剂盒（Thermo Fisher Scientific）制备所有EV制剂用于液相色谱质谱（LC-MS/MS）分析。简言之，使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的说明测量所有EV样品中的总蛋白量。调整EV样品体积以在所有样品中保持5 μg总蛋白。裂解EV样品，变性，并进行酶消化，然后纯化并洗脱溶液中的肽片段。使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）对EV蛋白质组进行数据非依赖性采集蛋白质组学分析测序。使用Spectronaut（v19.6.250122；Biognosys）进行谱图库搜索和差异表达分析，以鉴定蛋白质及其相对丰度。生成总蛋白和显著富集蛋白列表，并上传到DAVID工具进行基因本体分析。

2.9 EV表面标志物的Exoview分析

为了在单囊泡尺度上进一步可视化EVs，按照制造商的说明使用基于免疫捕获的Leprechaun Kits（Unchained Labs）。简言之，预扫描芯片并将其放入24孔板中。将EV样品在孵育缓冲液中稀释至1–3 × 10⁹颗粒/mL，并将35–50 μL稀释的EV溶液移液到芯片上。在室温下过夜孵育后，在ExoView CW100平板清洗器中使用MilliQ水和试剂盒中的缓冲溶液清洗芯片。将含有CF647-抗CD63、CF555-抗CD81和CF488-抗CD9的检测抗体溶液在封闭溶液中添加到每个芯片上，然后放入平板清洗器中进行自动孵育和冲洗循环。在NanoView R100仪器上进行图像采集，一次最多可转移九个芯片到卡盘上进行干涉测量和荧光成像。根据小鼠IgG阴性对照选择荧光截断值，事件数少于100个。下载结果并使用GraphPad Prism重新绘图。

2.10 在大鼠三培养模型中的EV摄取

按照先前描述的方法进行使用解剖大鼠细胞的原代皮质培养。大鼠幼崽脑解剖由Erkin Seker博士实验室（Hyehyun Kim, UC Davis）进行，并慷慨捐赠用于这些实验。使用铺板培养基将细胞混合物铺在涂有0.5 mg/mL聚-L-赖氨酸的玻璃底孔载玻片（8孔载玻片；Ibidi）上，铺板培养基由Neurobasal A培养培养基组成，补充有2% B27补充剂、1× Glutamax、10%热灭活马血清和pH 7.5的1M HEPES（全部来自Thermo Fisher Scientific）。以650 cells/mm²的密度铺板原代皮质细胞。在37°C和5% CO₂下4小时后，移除铺板培养基，并换用三培养培养基进行实验的14天持续时间。三培养培养基由Neurobasal A培养培养基、2% B27补充剂、1× Glutamax、100 ng/mL小鼠IL-34（R&D Systems）、2 ng/mL TGF-β（Peprotech）和1.5 μg/mL羊毛胆固醇（Avanti Polar Lipids）组成。每周新鲜制备三培养培养基，并在第3、7和10天更换一半培养基。在第14天，将EVs添加到混合皮质培养物中以评估混合培养环境中EV的优先摄取。将2 × 10⁸个荧光标记的PMSC EVs、星形胶质细胞EVs或混合EV制剂添加到每个孔中，在37°C和5% CO₂下放置4小时。将EVs与10 μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；Thermo Fisher Scientific）在37°C和5% CO₂下标记30分钟。之后，进行免疫荧光染色。简言之，用DPBS洗涤细胞培养物三次，并使用10%福尔马林PBS固定20分钟。用0.5% v/v TritonX（Thermo Fisher Scientific）透化固定细胞，并用1% BSA（Thermo Fisher Scientific）封闭1小时。将样品在4°C下在一抗溶液中孵育过夜，一抗溶液含有鸡抗GFAP（1:500稀释，Thermo Fisher）以及小鼠抗β-III微管蛋白（1:500稀释，Thermo Fisher Scientific）或小鼠抗IBA1（1:500稀释，Abcam），溶于封闭剂缓冲液中。第二天，洗涤后，将样品与二抗溶液孵育1小时，二抗溶液含有山羊抗鸡AlexaFluor594（1:500稀释，Thermo Fisher Scientific）和兔抗小鼠AlexaFluor 647（1:500稀释，Thermo Fisher Scientific）。最后，将样品与4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（在去离子H₂O中1:20,000稀释；Sigma）孵育5分钟，然后用DPBS洗涤并成像。对于共定位EV摄取分析，使用Olympus FV3000激光扫描共聚焦显微镜在10×或60×放大倍数下获取样品图像，并使用ImageJ进行分析。

2.11 通过添加EVs进行神经保护测定

将SH-SY5Y细胞以100,000 cells/cm²每孔的密度接种在48孔板（Corning Inc）中。如上所述用星形孢菌素处理细胞，并在300 μL S-5培养基中每孔添加2 × 10⁶个EVs。未处理EV的细胞作为对照。将细胞在37°C和5% CO₂下孵育。96小时后，用2 μM钙黄绿素AM（Thermo Fisher Scientific）洗涤细胞，并使用Axio Observer D1倒置显微镜（Carl Zeiss）成像。使用WimNeuron图像分析（Wimasis）处理图像以进行神经突生长分析。

2.12 胶质细胞极化测定

为了评估EVs的免疫调节潜力，将永生化BV2小胶质细胞和原代人星形胶质细胞（Gibco）分别培养在24孔组织培养处理板（Corning Inc）中，密度为50,000 cells/cm²每孔。星形胶质细胞在上述N-2补充培养基中培养。BV2小胶质细胞在含有10% FBS和1% P/S的DMEM中培养。BV2小胶质细胞由UC Davis（加利福尼亚州萨克拉门托）的Lee-Way Jin博士课题组慷慨赠送。对于BV2小胶质细胞，将1 mg/mL脂多糖（LPS，eBioscience）稀释在生长培养基中，每孔添加，在37°C、5% CO₂下放置48小时。对于星形胶质细胞，接种细胞24小时后，每孔添加1 μM Aβ_1-42（AG968，Sigma Aldrich），在37°C、5% CO₂下放置48小时。将人HFIP Aβ_1-42在DMSO中重悬至5 mM以制备寡聚体形式。将单体Aβ_1-42在不含酚红的F-12培养基（GE Life Sciences）中稀释至100 μM浓度，并在4°C下孵育24小时。星形胶质细胞或BV2小胶质细胞板在48小时孵育后，用各自培养基轻轻洗涤并进行免疫染色。

2.13 统计分析

数据报告为平均值±标准差。使用Prism 9软件（Windows OS版本9.2.1，Graphpad Software）进行统计分析，如果p < 0.05则认为差异显著。使用非参数Mann-Whitney-Wilcoxon t检验分析两组数据。使用Kruskal-Wallis检验进行多重比较，然后进行Dunn事后校正以确定哪些组存在统计学差异。

3 结果

3.1 单EV超分辨率显微镜揭示不同的四跨膜蛋白分布

驱动或源于神经退行性变的几个已确立的过程包括胶质细胞介导的神经炎症、脱髓鞘和神经元损失以及血脑屏障通透性。我们的核心假设是，通过胎盘来源间充质干细胞（PMSC）和星形胶质细胞融合产生的hEVs将在更大程度上减轻功能失调的神经退行性过程。这是通过在每个EV基础上合并EV生物分子内容物来实现的，从而产生更均质化和更有效的治疗剂。为了探索这一点，对单个PMSC和星形胶质细胞EV群体的物理特性进行了表征。根据方法中概述的既定方案，在2D组织培养瓶中对PMSCs和原代人星形胶质细胞进行培养。为了建立EV制剂的基础特征，在混合EV合成之前，根据ISEV 2023细胞外囊泡研究最低信息指南对天然PMSC EVs和星形胶质细胞EVs进行物理化学表征。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，对于PMSC EVs和星形胶质细胞EVs，三个供体EV制备物的尺寸分布曲线一致。Western blot分析显示，PMSC EV和星形胶质细胞EV样品纯度很高，Alix（95 kDa）、TSG101（44 kDa）、CD63（30–60 kDa）和CD9（24 kDa）呈阳性染色，并且在75至90 kDa之间没有钙联接蛋白。此外，对PMSC和星形胶质细胞裂解物的Western blot成像证实了分离的EVs中钙联接蛋白的耗竭以及CD63的富集。在冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）下成像的PMSC EVs和星形胶质细胞EVs具有圆形形态、层状结构和与EVs一致的尺寸。筛选了几个其他已建立的供体PMSC系，以观察任何可能混淆实验发现并限制我们报告的平台技术可转化性的供体变异性。通过NTA、超分辨率显微镜和cryo-TEM对来自五个PMSC供体系列的分离EVs进行了表征。供体PMSC EVs在尺寸、EV标志物表达和形态方面表现出相当的物理化学特性。在确认了PMSC EVs和星形胶质细胞EVs的纯度、质量和批次间一致性后，我们接下来试图在单EV水平上表征和量化它们的组成，以便为后续hEV合成提供详细的优化。单分子定位显微镜提供了在光的衍射极限以下荧光可视化生物标志物表达和量化相对丰度的能力。使用直接随机光学重建显微镜（dSTORM），我们首先通过膜蛋白表达谱确定了EV组成的异质性。四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81是常见的EV表面标志物，根据EV亲本细胞类型的不同，它们以不同的组合和水平存在。代表性的2D dSTORM图像显示，在PMSC EV和星形胶质细胞EV群体中均存在所有三种四跨膜蛋白标志物。PMSC EVs的CD9、CD63和CD81四跨膜蛋白标志物表达水平较高，每个EV的定位范围很大，尤其是CD63。另一方面，星形胶质细胞EVs表达更高水平的CD9。比较两个EV群体，当根据每个EV绘制单个四跨膜蛋白定位计数时，四跨膜蛋白分布是不同的。在所有三种可视化的四跨膜蛋白中，星形胶质细胞EVs的四跨膜蛋白计数高于PMSC EVs，每个星形胶质细胞EV的最大四跨膜蛋白计数大约是PMSC EVs的两倍。重要的是，根据Western blot和cryo-TEM分析，即使是在纯净和高质量的EV群体中，PMSC EV和星形胶质细胞EV样品对每种四跨膜蛋白标志物都有很大的定位范围，表明EV表面内容的多样性。

3.2 PMSC EVs和星形胶质细胞EVs具有不同的蛋白质货物和功能

为了证明hEV合成用于治疗应用的基本原理，我们希望阐明PMSC EV和星形胶质细胞EV群体之间的组成差异。众所周知，特定EV群体的功能是由它们携带的独特或差异表达的生物分子货物所赋予的。我们假设，比较PMSC EV和星形胶质细胞EV的蛋白质组成将鉴定出两种EV类型中独特和差异表达的蛋白质，这些蛋白质赋予它们独特的治疗特性。这将随后推动它们的融合，以创建一种均质化的hEV制剂，作为针对神经退行性疾病的具有功能优势的治疗剂。通过LC-MS/MS对PMSC EVs和星形胶质细胞EVs进行的定量蛋白质组学分析显示，有140种独特的PMSC EV蛋白质和354种独特的星形胶质细胞EV蛋白质，两组之间有2044种共享蛋白质。在共享蛋白质中，与PMSC EVs相比，有938种蛋白质在星形胶质细胞EVs中差异表达，q值 < 0.05。值得注意的是，许多差异表达的蛋白质在星形胶质细胞EVs中具有与补体激活和神经发生相关的功能，例如补体因子C5、补体因子B、S100蛋白和半乳糖凝集素-3。在PMSC EVs中，诸如HLA class C、血小板反应蛋白-2和calponin-2等蛋白质在免疫功能、组织修复和内皮细胞迁移方面存在差异表达。进行基因本体分析以鉴定与每个EV群体显著相关的生物过程。尽管显示PMSC EVs和星形胶质细胞EVs之间许多过程是保守的，但星形胶质细胞EVs明显参与细胞质翻译和细胞迁移。另一方面，PMSC EVs独特地参与蛋白质生物合成、ER-高尔基体运输途径和血管生成。这些在单个蛋白质水平和基因本体水平的差异表明PMSC EVs和星形胶质细胞EVs之间的功能不重叠。除了差异表达的蛋白质外，还鉴定了PMSC EVs和星形胶质细胞EVs独特表达的许多蛋白质。发现PMSC EVs独特表达诸如基质金属蛋白酶-16和RNA结合蛋白25等蛋白质，这些蛋白质参与凋亡和组织重塑。其他主要蛋白质功能类别包括血管生成、内皮功能和免疫调节。在星形胶质细胞EVs中，独特表达的蛋白质包括高尔基体SNAP受体和碳酸酐酶相关蛋白11，两者都参与神经保护和神经元活动调节。其他蛋白质包括那些参与神经炎症、脂质运输和免疫调节的蛋白质。这些由PMSC EVs或星形胶质细胞EVs独特表达的蛋白质突出了混合化和均质化EV制剂的治疗潜力。

3.3 混合EV的物理特性取决于膜融合的方法

在对PMSC EV和星形胶质细胞EV的纯度、质量、异质性和蛋白质组成差异进行严格表征后，我们得出结论，PMSC EVs和星形胶质细胞EVs参与了治疗相关且不重叠的过程，这值得将它们融合成hEVs，以将不同的功能组合到单一制剂中。为此，我们使用两种不同的方法（挤出和超声处理）进行膜融合以进行直接比较。 resulting hEVs再次进行物理化学表征以确定EV异质性。NTA结果显示挤出生成的hEVs和超声处理生成的hEVs的尺寸分布曲线相似。然而，超声处理hEVs在三个重复中具有更一致的尺寸曲线，表明其在批次间重现性方面具有优势。在物理特征的均质化方面，超声处理hEVs的尺寸介于PMSC EVs和星形胶质细胞EVs之间，而挤出hEVs具有更大的模态尺寸和尺寸范围。所有EV样品具有一致的Zeta电位值，但超声处理hEVs表现出最小的变异性。为了评估EV异质性和四跨膜蛋白分布曲线，我们使用ExoView R100仪器进行免疫捕获，然后进行单粒子干涉反射成像（SP-IRIS）。CD63/CD81/CD9四跨膜蛋白表达的SP-IRIS成像和定量显示，挤出hEVs和超声处理hEVs之间的四跨膜蛋白分布曲线高度保守，小鼠IgG捕获点检测到的污染物基线水平。除了CD63+ EVs上的高CD63水平外，在两种hEV制剂中，检测到的四跨膜蛋白水平在每个捕获点内保持相当一致。

3.4 超声处理混合EVs比挤出混合EVs具有更高的融合效率

在表征了这些挤出和超声处理生成的hEV制剂因其物理特性和四跨膜蛋白表面蛋白后，我们接下来确定了hEV