社区获得性尿路感染中大肠杆菌的高耐药性及高风险克隆ST1193的崛起

《MicrobiologyOpen》：High Rates of Antimicrobial Resistance and Emergence of High-Risk Clones in Community-Acquired Uropathogenic Escherichia coli

本刊推荐：这项研究深入分析了巴西社区获得性尿路感染（CA-UTI）中尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的临床和分子特征。研究发现，UPEC对常用抗生素如甲氧苄啶-磺胺甲恶唑（SXT）和氟喹诺酮类（如CIP/LEV）呈现高耐药率（>30%），而呋喃妥因（NIT）和磷霉素（FOS）仍保持高效。系统发育群B2（48%）是优势群，携带最多毒力基因，而A群与多重耐药（MDR）表型显著相关。值得注意的是，新兴的高风险克隆ST1193成为主导的MDR谱系。这些发现强调了基于本地耐药监测的精准治疗和持续社区 surveillance 的紧迫性，为遏制抗菌素耐药性（AMR）传播提供了关键数据。

　　

Graphical Abstract

研究团队对来自社区获得性尿路感染（CA-UTI）的98株大肠杆菌分离株进行了深入分析。结果显示，这些菌株对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑（SXT）和氟喹诺酮类药物表现出高耐药率。系统发育群B2是最主要的群体，并且与更高的毒力相关联。同时，ST1193作为新兴的多重耐药（MDR）克隆占据了主导地位。这些发现突出表明，需要对社区进行持续的监测，谨慎使用上述抗菌药物，并且区域性的耐药性监测对于指导治疗策略至关重要。

ABSTRACT

尿路感染（UTI）是全球最常见的细菌感染，在社区环境中常经验性治疗，这助长了抗菌素耐药性（AMR）的发展。尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是社区获得性尿路感染（CA-UTI）的主要病原体，然而关于其临床和分子特征的数据仍然有限。本研究旨在调查CA-UTI的临床和微生物学特征，重点关注抗菌素耐药性、系统发育群、毒力基因和克隆谱系。随机选取的CA-UTI病例大肠杆菌分离株进行了抗菌药物敏感性试验。通过PCR检测了β-内酰胺酶基因、系统发育群和关键毒力因子。采用多位点序列分型（MLST）进行克隆分型。通过结构化访谈获取临床和人口统计学数据。

在98株CA-UPEC分离株中，大多数来自女性患者（95.9%），中位年龄48岁。观察到对氨苄西林（50.0%）、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑（34.7%）和氟喹诺酮类（33.7%）的高耐药率，而对呋喃妥因和磷霉素的耐药率较低（1%）。多重耐药（MDR）菌株占24.5%，其中6.1%为超广谱β-内酰胺酶（ESBL）生产者，均携带bla_CTX-M型基因。系统发育群B2（48.0%）携带的毒力基因最多，而A群含有更多MDR菌株。常见的毒力基因包括fimH（95.9%）、PAI IV₅₃₆（77.6%）和fyuA（76.5%）。基因aer和iutA与MDR相关，而papC、sfa、hlyA在非MDR分离株中更常见。高风险克隆ST1193是最流行的谱系（25.0%），仅存在于MDR菌株中。ST73和ST127与多种毒力基因相关但为非MDR。呋喃妥因和磷霉素仍然是CA-UTI的有效治疗选择。持续监测对于指导治疗和追踪耐药趋势至关重要。

1 Introduction

尿路感染（UTIs）是全球最普遍的细菌感染之一，每年影响超过1.5亿人，并造成显著的社会和经济负担。社区获得性尿路感染（CA-UTIs）构成了这些病例的大部分，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是健康个体中约70-80%感染的元凶。在巴西，大多数关于UPEC的研究集中在南部和东南部地区，特征明确的研究仍然稀缺，限制了对全国流行病学情况的全面了解。

由于抗生素耐药性大肠杆菌菌株的快速出现和传播，管理UTI变得越来越具有挑战性。值得注意的是，产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌已被确定为公共卫生第二重要的优先病原体，其流行率不仅在医院环境中，而且在社区内也在增长。此外，对ESBLs、氟喹诺酮类和氨基糖苷类的耐药性严重限制了治疗选择，增加了治疗失败的风险，并常常需要使用碳青霉烯类等最后手段的抗生素。

UPEC菌株起源于不同的系统发育群，每个群与不同的毒力谱和抗生素耐药模式相关。大肠杆菌的致病性主要归因于多种毒力因子——如粘附素、铁获取系统和毒素——这些因子在UTI期间促进定植、侵袭、免疫逃避和组织损伤。这些毒力基因通常位于致病性相关岛屿（PAIs）上，它们可以在菌株之间水平转移，增强了UPEC的适应性和致病潜力。

流行病学研究表明，有限数量的流行序列类型（STs）导致了全球大多数ExPEC感染。具体而言，ST131、ST69、ST73、ST95、ST127、ST10和ST38已被确定为优势谱系，全球范围内共同占ExPEC感染的50%以上。这些谱系通常与多重耐药和/或增强的毒力相关，对UTI的全球负担有显著贡献。然而，关于这些CA-UPEC谱系在巴西分布的数据仍然稀缺。因此，本研究旨在表征来自CA-UTIs的UPEC分离株，重点关注其抗生素耐药谱、系统发育群、毒力因子和克隆谱系，以深入了解其致病潜力，并为有效的UTI管理支持针对性策略。

2 Material and Methods

2.1 Study Design and Recruitment Process

本研究纳入了2019年4月至2022年1月在巴西巴伊亚联邦大学药学院临床分析实验室进行的一项横断面研究中获得的CA-UTI患者样本。当在阳性尿培养中鉴定出大肠杆菌时，纳入疑似UTI并要求进行尿培养的患者，无年龄或性别限制。如果患者在先前阳性结果90天后再次出现大肠杆菌阳性尿培养，则视为新的分离株。

要将感染归类为社区获得性（CA），患者必须在过去30天内未接受静脉治疗、肾脏透析、侵入性尿路操作或任何专业或伤口护理。此外，他们必须在过去90天内未接受手术或住院，也未在尿培养采集前的12个月内居住在疗养院或长期护理机构。通过问卷调查收集有关性别、年龄、症状及其他相关临床和人口统计学数据。

2.2 Bacterial Identification and Antimicrobial Resistance Profile

阳性尿培养结果定义为生长≥10⁵ CFU/mL，并通过标准生化试验鉴定大肠杆菌分离株。

使用Kirby-Bauer纸片扩散法对19种抗生素进行抗菌药物敏感性试验，包括氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢呋辛、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、磷霉素和呋喃妥因，依据临床和实验室标准协会（CLSI）2023年指南。使用纸片近似试验调查ESBL生产，对至少三个不同抗菌类耐药的分离株被归类为多重耐药（MDR）。使用大肠杆菌ATCC 25922确保质量控制。

2.3 β-lactamases Genes

使用煮沸法从分离株中提取DNA，然后通过PCR扩增检测β-内酰胺酶基因，包括bla_SHV、bla_TEM、bla_OXA-1-like、bla_CTX-M-1、bla_CTX-M-2、bla_CTX-M-9、bla_IMP、bla_VIM、bla_KPC。此外，评估了bla_CTX-M型基因的存在。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳后观察，并使用l-Pix EX系统捕获图像。

2.4 Phylogeny Classification

通过PCR测定确定系统发育群，使用一组DNA标记将分离株分类为八个公认的群（A, B1, B2, C, D, E, F, G）和进化枝I。

2.5 Virulence Genes and Pathogenicity Islands

PCR测定也用于鉴定关键毒力因子基因：hlyA（溶血素）、cnf-1（细胞毒性坏死因子）、fimH（1型菌毛粘附素）、papC和papG（P菌毛）、sfa（S菌毛粘附素）、draD/afa（非菌毛粘附素）、traT（血清抗性相关外膜脂蛋白）、kpsM和neuA（荚膜）以及铁载体：iutA和aer（气杆菌素）、fyuA（耶尔森菌素）、iroN（沙门菌素）。进行三重PCR以检测主要致病性岛屿（PAIs），包括PAI I_CFT076、PAI II_CFT076和PAI IV₅₃₆。为评估菌株的毒力，分配了毒力评分（VS），每个检测到的基因得一分，并对aer和/或iutA的多重检测进行调整。

2.6 Genotyping by Multilocus Sequence Typing

对所有归类为MDR的分离株以及携带10个或更多毒力基因的分离株进行多位点序列分型（MLST）。使用基于七个看家基因（adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA, recA）内部片段测序的大肠杆菌MLST方案。使用大肠杆菌属PubMLST数据库确定每个分离株的序列类型（ST），并使用PHYLOViZ程序中实施的goeBURST算法分析数据。簇定义为共享五个或六个相同位点的STs组，包括创始ST及其单一位点变体（SLVs）或双位点变体（DLVs）。

2.7 Statistical Analysis

最初使用Fisher精确检验评估分类变量，使用Mann-Whitney U检验评估连续变量，以评估UPEC系统发育群、抗菌素耐药性和毒力因子存在之间的关联。应用二项逻辑回归模型评估毒力基因和系统发育背景作为特定抗菌药物耐药性预测因子的作用。构建多变量模型以调整潜在的混杂因素并解释多重比较。统计学显著性设定为p < 0.05。所有分析均使用RStudio软件进行。

3 Results

3.1 Clinical Characteristics

在研究期间，共进行了4,099次尿培养，其中451次（11.0%）呈阳性结果。在阳性培养中，大肠杆菌是最常分离到的病原体，占60.5%（282/451），其次是肺炎克雷伯菌（13.1%）、无乳链球菌（10.6%）、腐生葡萄球菌（2.4%）、产气克雷伯菌（2.2%）和柠檬酸杆菌属（1.3%）。其他微生物各占≤1%。

95名由大肠杆菌引起的CA-UTI患者同意参与研究。一名患者在研究期间经历了两次不同的UTI，另一名经历了三次，共获得98株大肠杆菌分离株。绝大多数感染发生在女性患者（95.9%；94/98），中位年龄为48岁（范围：31-65岁）。最常报告的合并症是糖尿病（22.4%；22/98）。主要临床症状包括尿灼痛（50.0%；49/98）和排尿困难（41.8%；41/98）。所有报告尿灼痛、排尿困难和发热联合症状的患者也报告了尿失禁。

3.2 Antimicrobial Resistance

相当一部分大肠杆菌分离株表现出对CA-UTI常用处方抗生素的耐药性，例如氨苄西林（50.0%）、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑（34.7%）、氟喹诺酮类（33.7%）、头孢呋辛（18.4%）和阿莫西林-克拉维酸（14.3%）。对氨曲南、第三代和第四代头孢菌素、庆大霉素和阿米卡星的耐药率较低。仅有一株分离株对呋喃妥因不敏感，另一株对磷霉素不敏感。未发现对哌拉西林-他唑巴坦、亚胺培南或美罗培南的耐药性。总体而言，70.4%的分离株对至少一种药物耐药，而其余则对所有测试的抗菌药物敏感。

MDR谱见于24.5%（24/98）的分离株，6.1%（6/98）被鉴定为ESBL生产者。此外，患有MDR分离株的患者（54岁）和产ESBL分离株的患者（58岁）的中位年龄高于非MDR分离株患者（45岁）。然而，差异无统计学意义。

还分析了β-内酰胺酶基因的存在，发现98株分离株中有33株呈阳性。其中25株携带bla_TEM，一株仅携带bla_CTX-M-1，两株仅携带bla_CTX-M-9，五株存在共存情况，包括组合如bla_TEM + bla_CTX-M-1；bla_TEM + bla_CTX-M-2；bla_TEM + bla_CTX-M-9；bla_TEM + bla_OXA-1-like，以及bla_TEM + bla_CTX-M-9 + bla_OXA-1-like。所有产ESBL大肠杆菌分离株均携带一个bla_CTX-M基因。

3.3 Phylogenetic Group Distribution

系统发育群B2是UPEC分离株中最普遍的，占菌株的48.0%（47/98），其次是B1（18.4%；18/98）、A（13.3%；13/98）和D（10.2%；10/98）。较少见的系统发育群包括F（4.1%；4/98）、C（2.0%；2/98）和E（2.0%；2/98）。根据Clermont方法，两个分离株无法归类到任何系统发育群。观察到系统发育群A与多重耐药表型之间存在统计学显著关联（p = 0.01）。

3.4 Virulence Genes Distribution and Association With Phylogroups

粘附素基因fimH是检测频率最高的（95.9%；94/98），其次是铁载体基因fyuA（76.5%；75/98）和荚膜合成基因kpsM（57.1%；56/98）。虽然总体流行率较低，但毒力基因papG、cnf-1、sfa和hlyA几乎仅见于属于系统发育群B2的分离株。此外，基因如neuA、kpsM、fyuA和致病性岛屿（PAI I_CFT073、PAI II_CFT073和PAI IV₅₃₆）与系统发育群B2显著相关（p < 0.05）。

系统发育群B2显示出携带多种毒力因子的分离株比例最高。值得注意的是，所有携带10个或更多毒力基因的分离株都是该群的成员。然而，当考虑每个分离株的平均毒力基因数时，系统发育群F尽管不常见，但显示出最高的毒力评分（每分离株7.5个基因），紧随其后的是B2（每分离株7.3个基因）。相比之下，传统上被认为是共生菌的A群和B1群显示出较低的毒力评分（每分离株分别为3.6和2.1个基因），但它们共同占本研究中所有CA-UTI病例的30%以上。

携带较多毒力基因的菌株（定义为毒力评分≥10，占分离株的13.5%）仅在系统发育群B2中发现。有趣的是，这些分离株显示出与抗菌素耐药性的反向关系：无一被归类为MDR，并且83.3%（10/12）缺乏任何测试的耐药基因。

在分析毒力因子与抗菌素耐药性之间的关系时，携带sfa、hlyA和papC的分离株对环丙沙星和左氧氟沙星的敏感性显著更高。此外，papC的存在与非MDR分离株强烈相关。另一方面，携带铁载体基因iutA和aer的分离株与对氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药性以及MDR表型显著相关（p < 0.05）。

3.5 MLST Analysis and Clonal Distribution

对36株分离株进行MLST分析，鉴定出16种不同的序列类型（STs）。最流行的是ST1193（25.0%；9/36），所有分离株均表现出氟喹诺酮类耐药并属于系统发育群B2。ST73和ST127是次常见的，各占四株分离株（11.1%）。

基于单一位点变体（SLVs）或双位点变体（DLVs）的GoeBURST分析揭示了两个主要的克隆复合体。克隆复合体CC14包含ST1193和ST14，代表10株分离株（27.8%）。克隆复合体CC10包括六株分离株（16.7%），分布在五个STs中：ST10（n=2）、ST44、ST617、ST744和ST1286（各n=1）。其余的STs是单例，在分析的数据集中没有显示克隆相关性。

MDR分离株分布在几个STs中，包括ST1193、ST131、ST10、ST224、ST38、ST44、ST46、ST410、ST617、ST744和ST1286。大多数MDR分离株（87.5%；21/24）属于与人类感染相关的高风险流行克隆。相比之下，携带最高毒力因子的分离株是ST73、ST127、ST698、ST95和ST14，它们都是非MDR。

4 Discussion

本研究中，大肠杆菌是社区获得性尿路感染（CA-UTI）中最常分离到的病原体。超过90%的病例发生在女性中，最高频率在31-59岁的个体中，这与来自巴西和日本的先前研究一致。糖尿病是最常见的合并症，这与它作为UTI主要风险因素的既定作用一致。

系统发育分析显示，大多数UPEC分离株属于系统发育群B2（48.0%），其次是B1（18.4%）和A（13.3%）。这一分布与埃及和罗马尼亚的发现一致，但与巴西其他地区的报告不同，那里观察到更高的B2和D群频率以及更低比例的A和B1群。值得注意的是，几项研究强调，系统发育群的分布即使在同一个国家或地理区域内也可能存在显著差异，反映了不同人群之间的巨大异质性。

研究结果强调，传统上被认为是共生菌的菌株，特别是属于A群和B1群的菌株（约占分离株的三分之一），能够引起肠外感染。这种能力归因于大肠杆菌在胃肠道内通过水平基因转移获得毒力基因的显著能力。获得这些基因增强了病原体的毒力潜力，促进了尿路的有效定植和感染。

本研究中观察到的抗菌素耐药模式强化了将呋喃妥因和磷霉素作为CA-UTI一线治疗的推荐。这些发现与巴西其他地区以及欧洲和中东的报告一致。研究结果强调了抗菌药物管理在减轻日益增加的耐药性风险方面的重要性，特别是对呋喃妥因的耐药性。虽然磷霉素由于相对成本较高且在公共医疗系统中不可用而仍未充分利用，但呋喃妥因更常被处方。此外，研究结果强调，在处方氟喹诺酮类和甲氧苄啶-磺胺甲恶唑时需要谨慎，因为尽管这些药物继续用于CA-UTI治疗，但分离株中的耐药率超过了30%。

CA-UPEC分离株中MDR表型和产ESBL菌株的频率与巴西其他研究报告的频率相当。相比之下，在墨西哥和伊朗观察到显著更高的耐药率，MDR和产ESBL菌株的流行率超过50。分析显示，MDR分离株与系统发育群A显著相关，这与巴西里约热内卢的发现不同，那里MDR菌株主要与B2、D和F群相关。此外，该地区最近的研究表明，产ESBL大肠杆菌的流行率低于百分之一。这突显了在过去十年中CA-UTI病例耐药性的令人担忧的增长。这种上升趋势是惊人的，并与社区环境中抗菌素耐药性增加的全球报告相符。

UPEC菌株拥有多种毒力因子，使它们能够有效定植尿路并逃避宿主免疫防御。在本研究中，所有分离株至少对两个分析的毒力基因呈阳性。最普遍的是fimH，它是UPEC致病性的关键组成部分，因为它介导对尿路上皮细胞的粘附。fimH基因已成为UTI预防的有希望的疫苗靶点，主要是因为特异性抗体能够抑制其功能并阻断膀胱定植。由fyuA和PAI IV₅₃₆编码的铁获取系统在CA-UTI的UPEC菌株中经常被检测到，流行率分别为76.5%和77.5%。类似发现已在其他研究中报告，因为该因子的表达在上升性UTI的发病机制中起关键作用，并且对于克服宿主环境（如尿液）中的铁限制至关重要。

有趣的是，观察到抗生素耐药性与毒力之间的反向关系。系统发育群F和B2表现出更高的毒力谱但主要是非MDR，这与其他报告毒力与耐药性正相关的研究发现相反。

关于分子分型，MLST分析显示ST1193是本研究MDR CA-UPEC分离株中的优势克隆，与中国的一项研究结果一致。相比之下，来自美国、加拿大和欧洲的研究报告了较低的ST1193频率；然而，其在UPEC和其他ExPEC分离株中的全球传播已在多个大陆得到充分记录。在巴西，先前的研究，特别是来自里约热内卢的研究，报告ST69、ST73和ST131是最流行的CA-UPEC谱系，一项采用"一体健康"方法的全国性研究强调了UPEC在巴西不同地区的克隆异质性，但未报告ST1193的存在，表明其作为新克隆在本地区的出现。

ST1193被认为是一个新兴克隆，研究结果强调了其在MDR社区相关分离株中日益增长的相关性。ST1193遵循与大肠杆菌ST131相似的进化轨迹，ST131通常被描述为"有史以来最成功的MDR克隆"，因为它们共享耐药特征、高传播性和日益增长的全球传播。重要的是，本研究中的大多数MDR分离株（87.5%；21/24）属于人类中的高风险流行克隆群，强化了流行克隆在传播抗菌素耐药性中的关键作用。

这项研究有一些局限性，最明显的是其局部范围，这可能限制研究结果的普遍性。招募也受到后勤挑战的限制，导致仅纳入符合条件病例的一部分。虽然MLST为克隆分布提供了重要见解，但缺乏全基因组测序以及质粒和整合子分析限制了对耐药性和毒力遗传决定因素的更深入探索。尽管如此，观察到的耐药模式以及高风险克隆（如ST1193）的出现反映了全球趋势，表明了更广泛的流行病学相关性。此外，该地区已发表数据的缺乏，加上得到详细临床数据支持的、特征明确的社区获得性感染的纳入，突显了本研究的相关性。

总之，大肠杆菌是本研究大多数CA-UTI病例的原因。系统发育群B2（具有广泛的毒力基因库）和系统发育群A（与更高的抗菌素耐药性相关）是最普遍的。在测试的抗生素中，呋喃妥因和磷霉素对本研究中的UPEC分离株显示出最高的疗效。相比之下，对常用经验性疗法（如氨苄西林、氟喹诺酮类和甲氧苄啶-磺胺甲恶唑）的高耐药率突显了需要基于本地耐药模式更新治疗指南。值得注意的是，ST1193成为主导的MDR克隆，其在社区环境中的日益增多强化了迫切需要综合监测和感染控制策略以遏制MDR大肠杆菌的传播。