利用NEON宏基因组数据挖掘美国土壤真核生物多样性：方法验证与生态模式解析

《Molecular Ecology Resources》：Characterising Soil Eukaryotic Diversity From NEON Metagenomics Datasets

本研究创新性地利用美国国家生态观测网络（NEON）的土壤shotgun宏基因组数据，开发定制化生物信息学流程（基于Barrnap的HMM profile靶向18S rRNA基因），成功解析了跨45个站点、6年时间序列的土壤真核生物群落（涵盖5183个属），验证了该方法在揭示管理强度（林业/放牧/耕地）、火灾干扰及生物群系特异性对土壤真核生物多样性（如真菌、后生动物）影响方面的有效性，为大规模土壤生物监测提供了新范式。

　　

研究方法创新：从原核靶向数据中挖掘真核生物信号

传统上，美国国家生态观测网络（NEON）的土壤宏基因组数据主要服务于原核生物（细菌和古菌）群落研究。本研究独辟蹊径，针对其测序深度相对较浅、真核生物序列占比低的特点，自主开发了一套定制化生物信息学分析流程。该流程的核心在于利用Barrnap软件的真核生物特异性隐马尔可夫模型（HMM）profile，从海量的shotgun宏基因组原始数据中高效提取18S核糖体RNA（rRNA）基因序列片段。

流程的关键步骤包括：对NEON特有的双端测序文件进行排序合并、使用Trimmomatic进行严格的质量控制和修剪、利用nhmmer（HMMER3套件组件）以1e-5的e值阈值筛选18S rRNA序列候选片段。随后，将获得的序列（平均长度约138碱基对）与PR²数据库（版本4.10.0）进行BLASTn比对，并施加严格的过滤标准（序列长度≥125 bp，查询覆盖率≥90%，一致性≥93%），以最大限度地保证分类学注释的准确性。作为对比，研究也使用了新兴工具Eukdetect进行分析，发现其在本数据集背景下灵敏度有限，仅检出35个属，且97%为真菌，凸显了定制流程在挖掘复杂环境中低丰度真核生物信号方面的优势。

土壤真核生物多样性图景：真菌与微小动物占主导

通过对45个NEON站点、1305份土壤样本的分析，研究共计回收了约136万条归类于真核生物18S rRNA的序列，平均每个样本贡献约800条有效序列。经过严格的生物信息学筛选，最终鉴定出5183个属，分属于35个门，全面涵盖了土壤中常见的动物门类（如节肢动物门、线虫动物门、轮虫动物门、缓步动物门、环节动物门）、多种原生生物（如纤毛虫门、尾丝虫门、管足虫门、古虫界）以及主要真菌门类（如子囊菌门、担子菌门、毛霉门）。

分析显示，真菌是土壤真核生物中最具多样性的类群，共鉴定出1734个操作分类单元（OTU），其中子囊菌门（906 OTUs）和担子菌门（475 OTUs）为主要贡献者。后生动物（Metazoa）次之，拥有1458个OTU，以节肢动物门（846 OTUs）和线虫动物门（242 OTUs）多样性最高。链型植物（Streptophyta，即高等植物）和尾丝虫（Cercozoa）也分别检测到801和132个OTU。这一多样性谱系与以往基于特异性扩增子测序的研究结果具有可比性，证实了从非靶向宏基因组数据中回收真核生物多样性信息的可行性。

环境驱动因子：弱相关性与类群特异性响应

研究进一步探讨了土壤真核生物OTU丰富度（即分类单元数量）与一系列环境因子之间的关系。混合效应模型分析揭示了一些显著但普遍较弱的相关性。总体真核生物丰富度与纬度、土壤含水量、全氮含量和有机碳含量呈显著正相关，而与土壤温度和土壤pH值（水提）呈显著负相关。

值得注意的是，不同高级分类群对环境因子的响应存在差异。例如，链型植物（自养生物）的丰富度仅与纬度显著正相关，而与土壤碳、氮含量无关；反之，异养类群（如后生动物、线虫）的丰富度则与有机碳含量显著正相关。土壤真核生物丰富度与纬度呈正相关的趋势，与地上生物通常表现出的纬度梯度格局（赤道地区多样性最高）相反，这可能源于土壤环境的缓冲效应、DNA在较冷气候下保存更佳或土壤生物特有的生态位分化。无机氮（铵态氮、硝态氮）有效性对各类群丰富度均无显著相关。这些结果表明，驱动土壤真核生物分布的环境因素具有明显的类群特异性。

生态应用验证：从人为管理到自然干扰

为检验所获数据的生态学意义，研究团队设计了三个验证案例，将分析结果与已知生态模式进行比对。

首先，比较了六对地理邻近但管理强度不同的站点（低强度 vs 高强度管理，涉及林业、放牧和耕地）。结果显示，在所有分类单元水平上，低管理强度站点的平均OTU丰富度显著高于高强度管理站点，平均减少约30个属级OTU（降低47%）。其中，环节动物门对管理强度响应尤为敏感，其丰富度在高强度管理下平均降低78%。而节肢动物门和线虫动物门的丰富度在不同管理强度间无显著差异，表明生物类群对干扰的响应存在特异性。

其次，分析了德克萨斯州CLBJ站点一次野火（发生在2017年至2018年期间）对土壤真核生物的影响。研究发现，从火灾前（2017年）到火灾后两年（2019年），所有分类单元的总丰富度呈现显著下降趋势。在门级水平上，子囊菌门的丰富度显著降低，而担子菌门和线虫动物门的变化不显著，再次印证了不同类群对干扰的响应各异。

最后，通过基于Jaccard相异指数的非度量多维尺度分析（NMDS）和相似性分析（PERMANOVA）评估了不同生物群系间真核生物群落组成的差异。结果表明，大多数NEON定义的生物群系拥有显著独特的真核生物群落结构。进一步分析显示，真菌中的子囊菌门在多种森林生物群系（混合林、木本湿地、落叶林）中群落结构相似，而节肢动物和线虫的群落结构在不同生物群系间的差异模式则有所不同，反映了不同生物类群分布的主导环境因子可能存在差异。

结论与展望：大规模土壤生物监测的新资源

本研究成功证明，通过开发针对性的生物信息学方法，能够有效地从并非为真核生物优化设计的NEON土壤shotgun宏基因组数据集中提取出具有生态学意义的真核生物多样性信息。所揭示的多样性分布模式、环境驱动因子以及生物类群对管理和自然干扰的特异性响应，与现有生态学认知基本吻合，验证了该数据资源的巨大潜力。

NEON数据集以其空间覆盖广、时间序列长、伴随环境数据详实而独具价值。这项工作为其在土壤真核生物研究领域的二次利用打开了大门。未来研究可进一步探索特定原生生物门类的生态学、评估更多环境压力（如干旱、洪水、飓风）的影响、比较不同生物信息学工具和数据库的效能，并随着测序技术的进步和数据库的完善，向更高分辨率的分类学水平和功能特征分析迈进。