基于多重核苷酸多态性标记系统的鱼类环境DNA精准识别与生物多样性监测研究

《Molecular Ecology Resources》：Development of a High-Resolution MNP Marker System for Aquatic Biodiversity Monitoring: A Case Study With Schizothorax prenanti in the Yangtze River

本文开发了一种针对齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）的多重核苷酸多态性（MNP）标记系统，通过设计115个短片段（~180 bp）MNP标记，实现了对环境中极低浓度（~1拷贝/反应）鱼类DNA的高灵敏度检测。该系统在长江流域环境DNA（eDNA）样本中成功应用，有效区分了近缘物种（S. davidi），精准评估了人工放流效果，为水生生物多样性监测提供了分辨率更高、可量化的新工具。

　　

增强环境DNA分析中MNP标记的灵敏度能力

在自然环境中，硬骨鱼类通过上皮细胞、黏液和代谢废物持续释放DNA，研究表明单条鱼每天可向水中释放多达10⁴–10⁵份线粒体DNA拷贝。然而，环境压力因素（包括酶降解、紫外线辐射和微生物活动）会迅速将环境DNA（eDNA）片段化为短片段（< 200 bp），并在流动生态系统中将其持久性缩短至仅数小时。在长江这样的大型河流流域，水动力扩散进一步将eDNA稀释至痕量浓度，使得依赖长扩增子或高DNA完整性的传统方法对物种检测无效。

本研究开发的MNP系统通过协同设计原则克服了这些限制。首先，短扩增子（180 bp）与降解eDNA片段的主要尺寸范围一致，使得MNP标记的检测效率凸显了其在识别齐口裂腹鱼（S. prenanti）方面的可靠性。具体而言，30份齐口裂腹鱼基因组DNA样本平均检测到107.33个MNP位点，平均检测率高达93.33%。相比之下，来自长江的56份eDNA样本平均检测到77.02个位点，平均检测率为66.97%，反映了eDNA样本中的DNA降解情况。尽管检测率有所降低，但在eDNA样本中检测到至少一个标记的概率在数学上保证为100.00%。此外，我们观察到eDNA样本检测率的标准偏差（21.96%）是基因组DNA样本（3.00%）的7.32倍，表明不同eDNA样本间DNA丰度和降解水平存在显著变异性。

其次，MNP标记系统在定量eDNA样本中的齐口裂腹鱼DNA方面表现出卓越的灵敏度。通过引入外部DNA Spike-in作为定量参照，能够以高精度和高灵敏度（约1拷贝/反应）估算DNA拷贝数。在测试的六份eDNA样本中，平均齐口裂腹鱼DNA拷贝数为3204，每个反应最高为12372拷贝，最低为317拷贝，这些结果强调了其检测和定量低丰度eDNA的能力。

使用MNP标记评估人工放流的遗传贡献

准确区分近缘物种和降解的eDNA样本是水生生物多样性研究中持续存在的挑战。我们的MNP标记系统展示了卓越的判别力，所有标记的平均判别力值为0.77。此外，30份齐口裂腹鱼基因组DNA样本与56份eDNA样本之间的遗传分化率平均达到84%。如此高的比率反映了eDNA样本的复合性质，其捕获了来自不同栖息地的多个个体或亚群群的DNA，也体现了MNP标记的高分辨率。

由于在近缘物种（如重口裂腹鱼 S. davidi）中存在交叉扩增的可能性，eDNA检测中出现假阳性是一个关键问题。我们的验证表明，尽管86%的标记在物种间能扩增，但序列变异确保了在组织样本中的区分能力。对于eDNA，核心等位基因（Core Alleles）增强了特异性，尽管仅用三份重口裂腹鱼样本进行验证限制了普适性。长江中的其他裂腹鱼属物种可能共享等位基因，需要进行更广泛的测试。这些局限性凸显了未来需要增加采样量以优化该标记组在eDNA应用中适用性的需求。

值得注意的是，我们的方法在概念上与基于eDNA的种群定量最新进展有相似之处，例如利用分离的线粒体位点来估算物种丰度。两种方法都通过利用进化种群内部的遗传异质性来解决传统eDNA浓度指标的局限性。然而，这些系统在操作规模和分辨率上存在根本差异。例如，相关研究在受控的中宇宙中使用11个预选线粒体序列多态性位点来推断鱼类数量，而我们的MNP标记靶向核基因组变异（115个位点），专门为在复杂的河流环境中追踪齐口裂腹鱼而优化。

这种以核基因组为重点的方法在评估长江等大型、生物多样性丰富的生态系统的人工放流结果方面提供了关键优势。人工放流计划是长江保护工作的核心，但由于无法区分放流种群和自然种群，其有效性历来难以评估。评估放流成功率的现有方法，如标记重捕技术、耳石微化学和传统遗传分析，都存在显著局限性。标记重捕研究劳动强度大，在大型河流系统中具有物流挑战性，并且仅限于短期评估。耳石微化学需要侵入性取样，并且提供的遗传整合信息有限。使用简单序列重复（SSR）或线粒体标记的传统遗传方法通常缺乏大规模生物多样性评估所需的分辨率和可扩展性。

我们的研究为这一挑战提供了解决方案，我们识别出1400个自然齐口裂腹鱼种群（eDNA）特有的独特等位基因和155个放流种群特有的独特等位基因。这种遗传区分能力为评估放流计划的关键方面提供了前所未有的精确度，包括放流个体的存活和整合、其繁殖成功以及与自然种群潜在杂交的可能性。同时解决物种区分、种群动态和放流有效性的能力，使MNP标记系统成为水生保护的一项变革性工具。

应对技术挑战及扩展MNP在水生生态系统中的应用

尽管在我们的样本中，许多位点显示出齐口裂腹鱼特有核心等位基因的排他性出现，但跨物种测试有限（ notably S. davidi, n=3）。因此，我们将"物种特异性"的说法限制在我们的验证数据集内，并建议扩大实证测试范围，纳入在长江流域采样的更多同属物种。我们在此提供一个明确的、保守的决策规则，作为实际监测的操作建议：当（1）检测到至少三个推定的齐口裂腹鱼特异性MNP核心等位基因，并且（2）每个检测到的等位基因在至少一个独立的PCR重复中有不少于10条经过质量过滤的读长支持时，水样可判定为齐口裂腹鱼阳性。

理论上，MNP标记的开发需要高质量的参考基因组——这对于非模式生物（它们主导着像长江这样的生物多样性热点地区）来说是一个关键障碍。然而，我们的研究表明，限制性位点相关DNA测序（RAD-seq）可以绕过对完整基因组的需求。通过从RAD-seq数据中生成足够的多态性位点，RAD-seq使数据缺乏的物种也能开发MNP标记——这一方法上的飞跃与全球研究特征不明类群的 efforts 相一致。然而，RAD-seq需要生物信息学专业知识进行数据处理和质量控制，并且初始测序成本可能限制资源有限实验室的采用。为了增强可及性，开源流程和标准化协议可以缓解这些障碍。

将MNP标记扩展到多物种组合（如群落水平生物多样性评估所提议的）是有前景的，但也面临挑战。这些挑战包括跨物种可能存在的标记重叠，需要进行严格的特异性测试，以及避免交叉扩增所需的复杂引物设计。未来开发通用MNP组合的努力可以利用高通量引物优化和机器学习来简化标记选择，在保持分辨率的同时确保可扩展性。

此外，水生生态系统的动态特性（例如，DNA快速降解、环境条件波动）使eDNA工作流程的标准化复杂化，存在研究间遗传数据不一致的风险。为了应对这些挑战，将MNP流程与优化的eDNA协议（例如，快速现场过滤、用于DNA保存的稳定缓冲液）相结合可能减轻环境变异性。例如，将MNP分析与机器学习驱动的降解模型相结合，可能使研究人员能够统计校正DNA片段化效应，从而增强跨研究的可比性。

未来的研究应优先关注两个方向：（1）扩展MNP应用到多物种组合，实现群落水平的生物多样性评估，同时保持物种水平的分辨率。此类组合可以揭示复杂生态系统中的营养相互作用或栖息地分配模式。（2）将机器学习算法与MNP数据集集成，以预测气候变化或栖息地碎片化下的种群轨迹。这些努力将使遗传监测与预测生态学相结合，促进主动而非被动的保护。