通过H2O2引发的脱硼反应实现苯硼酸-海藻酸盐的细胞相容性酶促水凝胶化

《Macromolecular Materials and Engineering》：Cytocompatible Enzymatic Hydrogelation of Phenylboronic Acid-Alginate via H2O2-Triggered Deboronation

动态硼酸酯-海藻酸钠水凝胶成型系统开发及其生物相容性研究。通过H?O?触发的硼酸酯动态键断裂和HRP介导的酚-酚共价交联，无需添加剂即可制备兼具动态响应和静态机械稳定性的水凝胶，并验证了HepG2细胞在pH 7.4和8.0条件下的良好存活与增殖能力。

　　本文探讨了一种创新的水凝胶化方法，该方法利用了动态和静态特性相结合的机制，且无需额外添加物质。水凝胶因其良好的生物相容性和独特的粘弹性，在再生医学、组织工程和柔性电子等领域展现出广泛的应用潜力。然而，传统水凝胶制备方法通常依赖于外部添加剂来赋予特定的功能，如剪切变稀性、pH响应性和自修复能力，这不仅增加了系统的复杂性，也可能带来不可预测的副作用。因此，开发一种无需添加物、能够实现动态-静态过渡特性的水凝胶化策略显得尤为重要。

本研究中，科学家们提出了一种基于氢过氧化物（H?O?）触发和辣根过氧化物酶（HRP）介导的水凝胶化方法。该方法使用一种3-氨基苯基硼酸接枝的海藻酸（Alg-3APBA）作为前驱体材料，通过H?O?引发的脱硼反应和随后的HRP介导的酚-酚交联反应，实现水凝胶的形成。这种方法的优势在于，其动态特性来源于硼酸与二醇基团之间的可逆相互作用，而静态特性则来自于酚-酚之间的共价交联。这种动态-静态结合的水凝胶系统在保持材料功能多样性的同时，减少了对额外添加剂的依赖，为未来生物功能材料的设计提供了新的思路。

研究首先通过化学偶联反应合成了Alg-3APBA。合成过程涉及将3APBA与海藻酸钠进行反应，使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和水溶性碳二亚胺盐酸盐（WSCD·HCl）作为偶联试剂，最终在碱性条件下通过沉淀和洗涤得到产物。合成后的Alg-3APBA通过1H-NMR和紫外-可见光谱（UV-Vis）进行了表征，以确认其结构和功能基团的引入。结果显示，Alg-3APBA在281 nm处的吸收峰与3-氨基苯酚的形成密切相关，从而间接计算了其取代度，约为每单糖单元13.2 mol%。

接下来，研究者通过流变仪对Alg-3APBA前驱体的粘弹性特性进行了系统评估。结果显示，Alg-3APBA前驱体在不同浓度（0.5、1.0和1.5 w/v%）和不同pH值（6.5、7.4和8.0）下表现出显著的pH依赖性粘弹性变化。其中，在pH 7.4和8.0条件下，前驱体在H?O?存在下形成了稳定的水凝胶结构。这一结果表明，Alg-3APBA在pH值高于其pKa（8.5）时能够有效进行脱硼反应，并在HRP催化下形成共价交联，从而实现水凝胶的稳定结构。相比之下，在pH 6.5条件下，H?O?无法引发足够的脱硼反应，导致水凝胶无法形成。

为了进一步研究水凝胶的形成过程，研究者采用了葡萄糖氧化酶（GOx）系统，以连续且可控的方式生成H?O?。在pH 7.4和8.0条件下，随着H?O?的持续供应，Alg-3APBA前驱体的G'（储能模量）和G''（损耗模量）均发生了显著变化，表明其从溶胶状态向凝胶状态的转变。通过计算tanσ（G''/G'）值，研究者发现，在pH 7.4和8.0条件下，Alg-3APBA前驱体表现出类似凝胶的粘弹性特征，而pH 6.5条件下则没有明显变化。这一结果进一步验证了H?O?浓度和pH值对水凝胶形成的关键影响。

此外，研究者还分析了H?O?浓度和HRP浓度对水凝胶形成时间及机械性能的影响。结果表明，随着HRP浓度的增加，水凝胶的形成时间显著缩短，而H?O?浓度的增加则加快了脱硼反应速率，从而提高了水凝胶的机械强度。在H?O?浓度为7.5 mM时，水凝胶的杨氏模量（Young's modulus）达到了最高值，约为2.8 kPa，而在10 mM时，虽然模量略有下降，但其机械稳定性依然良好。这些结果表明，通过调控H?O?和HRP的浓度，可以实现对水凝胶机械性能的精确控制。

为了验证水凝胶的机械稳定性，研究者设计了一种实验，将两个Alg-3APBA前驱体水凝胶在接触后无缝融合，并在PBS中观察其形态变化。结果表明，当水凝胶暴露于含有H?O?的空气中时，其形态保持良好，而在未暴露的情况下则迅速溶解。这一现象表明，H?O?的存在不仅促进了脱硼反应，还通过HRP的催化作用实现了稳定的酚-酚交联，从而增强了水凝胶的机械性能。

在细胞相容性方面，研究者将HepG2细胞封装在Alg-3APBA水凝胶中，并在不同H?O?浓度下评估其存活率和增殖能力。结果显示，在H?O?浓度低于10 mM时，HepG2细胞的存活率和增殖能力均保持良好，且没有出现明显的细胞毒性。这表明，该水凝胶化系统在生物医学领域具有良好的应用前景。此外，研究还发现，Alg-3APBA具有一定的抗氧化能力，这可能与其结构中的3-氨基苯基硼酸基团有关，能够在H?O?环境中保护细胞免受氧化损伤。

尽管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。首先，目前的研究仅限于使用海藻酸和3APBA的组合，尚未探索其他酚基硼酸衍生物与二醇类聚合物的组合是否具有类似的功能。由于硼酸的pKa值对动态键的形成和脱硼反应速率具有显著影响，因此不同pKa值的硼酸衍生物可能会对水凝胶的性能产生不同的影响。此外，HRP介导的交联反应速率也受到生成酚类化合物结构的影响，这意味着未来的研究需要进一步探索不同结构的酚类化合物在水凝胶化过程中的行为。

其次，本研究主要通过HepG2细胞评估了水凝胶的细胞相容性，但尚未对其他细胞类型（如成纤维细胞、干细胞和免疫细胞）进行系统的评估。不同细胞类型对水凝胶环境的响应可能有所不同，因此未来的实验需要涵盖更多细胞类型，以全面评估该系统的生物相容性。此外，虽然水凝胶在体外表现出良好的性能，但其在体内的降解行为、生物相容性以及实际功能仍需通过动物实验进一步验证。

最后，本研究主要关注了水凝胶化系统的构建及其基本性能的评估，尚未将其应用于具体的生物医学场景。例如，在3D生物打印领域，动态前驱体的特性可以确保打印过程的顺利进行，而随后的H?O?触发的静态交联则能够确保打印结构的稳定性。此外，该水凝胶的抗氧化特性也使其在含活性氧的药物输送系统中具有潜在应用价值。未来的研究可以进一步探索该系统在生物打印、可注射水凝胶和细胞培养支架等具体应用中的表现。

综上所述，本文提出了一种无需添加剂、能够实现动态-静态过渡特性的水凝胶化方法，其核心在于利用H?O?触发的脱硼反应和HRP介导的酚-酚交联反应。该系统不仅能够赋予水凝胶良好的机械性能和pH响应性，还具有良好的细胞相容性，为未来的生物医学应用提供了新的可能性。然而，为了进一步推广该方法，仍需对其他酚基硼酸衍生物与二醇类聚合物的组合进行研究，并对不同细胞类型和体内环境下的性能进行深入探讨。此外，还需要优化水凝胶的制备条件，以实现更广泛的应用范围和更高的功能性。