基于CRISPR/Cas9基因编辑与靶向代谢组学揭示喜盐菌中四氢嘧啶代谢通量重编程

《Journal of Biotechnology》：CRISPR/Cas9-Based Gene Deletion and Targeted Metabolomics Reveal Ectoine Flux Reprogramming in Halomonas campaniensis

本文采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建喜盐菌（Halomonas campaniensis）XH26的hom/doeA基因缺失菌株，通过靶向代谢组学和RT-qPCR技术揭示四氢嘧啶（ectoine）合成通量重编程机制。研究发现基因敲除促使中心碳代谢流向ectoine生物合成途径聚集，使其产量提升13.3%-33.3%，为高产工程菌株构建提供新策略（DOI待补充）。

　　

菌株与培养基

野生型喜盐菌XH26（保藏号CCTCC M2019776^M）及其代谢缺陷菌株XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA由青海大学医学研究中心保藏。基础培养基包含58.50 g/L NaCl、55.88 g/L KCl、24.65 g/L MgSO₄·7H₂O、9.83 g/L谷氨酸钠（MSG）、3.00 g/L柠檬酸钠、7.50 g/L酪蛋白酶解物、0.20 g/L无水CaCl₂、2.00 g/L酵母提取物和5.00 g/L葡萄糖。四氢嘧啶发酵...

四氢嘧啶生物合成与代谢基因敲除的验证

提取XH26、XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA菌株的基因组DNA作为模板，使用特异性引物（hom-F/hom-R和doeA-F/doeA-R）进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（图2）。第1、2泳道对应野生型XH26菌株，分别显示hom和doeA基因片段扩增条带，大小位于2,000-3,000 bp区间，其中hom基因约2,500 bp（预期2,458 bp），doeA基因约2,400 bp...

基因敲除对细胞形态与四氢嘧啶产量的影响

单基因或多基因编辑可显著影响细菌生长和代谢物积累。例如，Zhang等将ectABC基因簇导入大肠杆菌并敲除lysA基因，构建的代谢工程菌株ET03使四氢嘧啶产量达到1.08 g/L，较亲本提升2.08倍。类似地，Lim等敲除doeA基因...

结论

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建两种代谢缺陷菌株（XH26/Δhom和XH26/Δhom/ΔdoeA）。与野生型XH26相比，缺陷菌株胞内四氢嘧啶产量显著提升：XH26/Δhom增加13.3%（0.51 g/L），XH26/Δhom/ΔdoeA增加33.3%（0.60 g/L）。同时，两种缺陷菌株的甜菜碱产量分别下降73.08%（0.07 g/L）和76.92%（0.06 g/L）。RT-qPCR显示asd、lysC、ectA、ectB、ectC基因显著上调，靶向代谢组学表明差异代谢物主要参与四条核心能量代谢通路。这些发现证实通过阻断竞争性路径可重构碳代谢流，为高产四氢嘧啶工程菌株开发提供理论支撑。