鹿血抗氧化肽的分离鉴定及其通过Keap1-Nrf2通路改善小鼠酒精性肝损伤的作用与机制研究

《Journal of Functional Foods》：Isolation, identification, and computational analysis of antioxidant peptides from deer blood and its therapeutic effects on alcoholic liver injury in mice

本研究针对酒精性肝病(ALD)缺乏高效低毒治疗药物的现状，研究人员开展了鹿血抗氧化肽(DBP)的提取优化、活性评价及作用机制研究。通过单因素优化结合响应面法确立了DBP的最佳酶解工艺，发现DBP能显著提升H2O2诱导的HepG2细胞存活率，增强SOD、CAT、GSH-Px活性并降低MDA水平；在酒精性肝损伤小鼠模型中，DBP有效降低了血清ALT、AST、IL-6和TNF-α水平，改善了肝脏抗氧化状态。通过肽组学分析鉴定出13种潜在抗氧化肽，分子对接显示PP11与Keap1具有高亲和力(-10.2 kcal/mol)，提示其可能通过调控Keap1-Nrf2通路发挥肝保护作用。该研究为ALD的防治提供了新型候选药物，并促进了鹿血资源的高值化利用。

　　

推杯换盏的社交场合背后，酒精过量摄入所引发的酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease, ALD)已成为全球性的公共卫生问题。长期酗酒会导致肝脏代谢超负荷，产生大量有毒的乙醛和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，破坏肝细胞内的氧化平衡，引发氧化应激、炎症反应乃至肝纤维化、肝硬化。目前临床缺乏特效且副作用小的治疗药物，传统的合成抗氧化剂又存在肾损伤、肝毒性等安全隐患。因此，从天然产物中寻找高效低毒的抗氧化活性成分，成为ALD防治研究的新方向。

在这一背景下，发表于《Journal of Functional Foods》的研究论文《Isolation, identification, and computational analysis of antioxidant peptides from deer blood and its therapeutic effects on alcoholic liver injury in mice》为我们带来了新的希望。该研究聚焦于鹿血——这一在传统医学中已被广泛应用但现代研究尚不充分的资源，旨在挖掘其中蕴含的抗氧化肽(Deer Blood Peptides, DBP)，并系统评估其对酒精性肝损伤的保护作用及分子机制。

为了高效获取活性成分，研究人员首先建立了一套优化的DBP制备工艺。他们通过单因素实验筛选出最适蛋白酶——木瓜蛋白酶，进而利用响应面法(Response Surface Methodology, RSM)精确优化了酶浓度、底物浓度、pH值等关键参数，最终使DBP的DPPH自由基清除率达到91.35%，水解度(Degree of Hydrolysis, DH)为19.86%。对获得的DBP进行表征发现，其组分中98.36%的分子量小于3 kDa，且富含甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)等具有抗氧化潜力的氨基酸。紫外(UV)吸收光谱在220 nm处出现最大吸收峰，傅里叶变换红外(FTIR)光谱显示出酰胺I带、II带等特征峰，证实了其多肽结构。生物安全性评估显示，DBP在实验浓度下无溶血活性和细胞毒性，且经模拟胃肠液消化后仍能保持较好的自由基清除能力，表明其具有良好的生物相容性和稳定性。

在活性评价方面，研究团队通过体外细胞模型和体内动物模型，层层深入地验证了DBP的抗氧化和肝保护功效。在H₂O₂诱导的HepG2细胞氧化损伤模型中，DBP预处理能显著提高细胞存活率，并剂量依赖性地增强超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GSH-Px)的活性，同时降低脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的水平。这初步证明了DBP能够缓解氧化应激对细胞的损伤。

更重要的是，在酒精诱导的小鼠急性肝损伤模型中，DBP展现出全面的保护作用。与模型组相比，DBP治疗组（特别是高剂量组1200 mg/kg）的小鼠肝脏指数显著降低，血清中的肝损伤标志物——谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显下降，炎症因子白介素-6(Interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)的释放也受到抑制。肝脏组织病理学切片（H&E染色）观察显示，DBP处理减轻了肝细胞脂肪变性，减少了脂滴堆积，使肝细胞形态和结构趋于正常。同时，肝脏组织匀浆中SOD、GSH-Px活性回升，MDA含量降低，表明DBP通过提升机体自身的抗氧化防御能力，减轻了酒精引发的氧化损伤。

那么，是DBP中的哪些成分发挥了关键作用？其作用机制又如何？研究团队进一步采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对DBP进行了肽组学分析，共鉴定出7086条肽序列。通过PeptideRanker生物活性预测（评分>0.9）和BIOPEP-UWM数据库功能注释，筛选出13条具有潜在抗氧化活性的肽段。分子对接(Molecular Docking)模拟显示，这些肽段都能自发地与常用的抗氧化评价指标——DPPH自由基和ABTS阳离子自由基结合，结合能分别在-3.2至-4.8 kcal/mol和-3.4至-4.0 kcal/mol之间。其中，FK10、SH19等肽段与自由基形成了较多的氢键和疏水相互作用，提示其具有较强的直接自由基清除能力。

为了验证计算结果的可靠性，研究人员合成了两条评分较高、溶解性好的肽段QGPLEPGPAGNRGCGRK (QK17) 和 PPSPGAMPRPP (PP11)进行体外验证。结果表明，两者均具有显著的DPPH和ABTS自由基清除活性，且对HepG2细胞无毒性，并能有效抵抗H₂O₂诱导的氧化损伤。

机制的探索并未止步于此。深入的分子对接分析揭示，PP11与Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) 蛋白表现出极高的亲和力，结合能低至-10.2 kcal/mol。Keap1是细胞内重要的氧化应激传感器，正常情况下它与转录因子Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) 结合并促进其降解。当PP11竞争性地与Keap1结合后，可能解除了对Nrf2的抑制，使Nrf2进入细胞核，启动下游一系列抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表达，从而增强细胞的整体抗氧化能力。此外，PP11还能与炎症通路关键蛋白IKK-β (Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta) 结合（结合能为-5.6 kcal/mol），这意味着它可能通过抑制NF-κB信号通路的活化，减少TNF-α、IL-6等促炎因子的产生，间接发挥抗炎和保护肝脏的作用。

综上所述，本研究通过系统的工艺优化、活性评价和机制探索，充分证明了鹿血抗氧化肽(DBP)在防治酒精性肝病方面的巨大潜力。研究不仅建立了一套高效的DBP制备方法，证实了其在细胞和动物水平上的显著抗氧化和肝保护功效，还通过肽组学和生物信息学分析鉴定出关键活性肽段，并初步揭示了其可能通过调控Keap1-Nrf2和NF-κB等重要信号通路发挥作用的分子机制。这些发现不仅为开发新型ALD治疗药物或功能性食品提供了重要的候选物质和理论依据，也为鹿血这一传统资源的现代化、高值化利用开辟了新的途径，具有重要的科学意义和应用前景。未来的研究可进一步聚焦于关键活性肽的体内药效验证、详细的作用通路解析以及相关的制剂开发和临床前安全性评价。