新型合成氨基酸的生物大分子相互作用及其抗氧化特性：这些氨基酸针对DNA和血清白蛋白

《Journal of Molecular Liquids》：Biomacromolecular interactions and antioxidant properties of novel synthetic amino acids targeting DNA and serum albumin

人工氨基酸的合成及其与DNA、BSA的相互作用及抗氧化活性研究。采用化学合成、圆二色光谱（CD）和分子对接技术，合成了两种新型螺环喹唑啉含人工氨基酸（4和5），并评估其抗氧化活性。DPPH实验显示，化合物4和5的IC50值分别为0.334和0.347 mM，显著高于起始材料2（0.81 mM），但低于维生素C（0.232 mM）。CD光谱表明，化合物4和5均能改变BSA的二级结构，其中4导致更显著的α-螺旋破坏（Δα-螺旋-29.91%），而5的随机卷曲增加更明显（Δ随机卷曲+26.11%）。分子对接显示，5与DNA和BSA的相互作用更复杂，形成氢键和疏水作用，尤其在DNA中表现出更强的结合（HDOCK评分-167.83 vs -138.00）。研究为人工氨基酸在抗氧化和靶向药物递送中的应用提供了理论依据。

　　本研究探讨了两种合成氨基酸在生物大分子相互作用及抗氧化活性方面的特性。这些合成氨基酸因其非天然来源和代谢稳定性，被视为具有显著生物医学潜力的真正合成物质。通过化学合成、结构表征以及抗氧化活性评估，研究揭示了这些氨基酸与生物大分子如双链DNA（dsDNA）和血清白蛋白（BSA）的相互作用能力。利用小牛胸腺DNA和牛血清白蛋白作为模型系统，通过多学科实验方法研究了这些衍生物的结合特性及对dsDNA和BSA结构的影响。研究结合了合成化学与分析和光谱技术，尤其是圆二色（CD）光谱学，以监测dsDNA和BSA在肽结合过程中的构象变化。CD光谱解卷积提供了合成氨基酸与生物靶标相互作用的机制洞察。此外，分子对接模拟被用于探索这些合成氨基酸与dsDNA和BSA的潜在结合位点及相互作用能量。

研究结果表明，这些人工氨基酸能够显著调节DNA和血清白蛋白的二级结构，突显了它们在生物医学研究中的潜在应用价值。同时，我们首次提供了证据表明，由合成途径得到的氨基酸具有对抗多种来源引起的氧化损伤的保护潜力，这通过我们的DPPH实验得到验证。这项工作扩展了对合成-生物大分子相互作用的理解，并强调了非天然氨基酸作为核酸和蛋白质调节剂在治疗应用中的前景，以及它们作为抗氧化剂的潜力。

在引入氧化应激的概念时，我们了解到氧化应激已成为科学研究的焦点，因为自由基与抗氧化剂之间的不平衡可能导致蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物的损伤。当活性氧（ROS）的产生超过身体的中和能力时，氧化应激就会发生。过量的ROS会对细胞成分造成伤害，包括DNA、蛋白质和脂质，从而导致慢性炎症和多种疾病的发展，如动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病、阿尔茨海默病和癌症。合成物，包括有毒金属如镉、砷和镍，已被证实会诱导氧化应激，这与上述病理学密切相关，尤其是癌症，因为这些金属能生成ROS，损伤DNA并激活红ox敏感的转录因子，从而促进致癌作用。尽管氧化应激的确切机制尚未完全明确，但已知慢性低剂量暴露于这些金属可能触发DNA修复反应或肿瘤形成。同样，环境合成物及其代谢产物也可能通过持续释放超氧自由基，促进DNA损伤并参与致癌过程。ROS不仅导致DNA的直接损伤，还激活关键的信号通路，如NF-κB、JNK/SAPK和Erk/MAPK，这些通路可能促进细胞增殖或使细胞对凋亡产生抵抗力。因此，天然和合成的抗氧化剂在对抗ROS诱导的细胞损伤、维持细胞功能和支持整体健康方面发挥着至关重要的作用。通过减轻氧化应激，抗氧化剂有助于调控与癌症进展相关的信号通路，抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。它们的潜在抗癌特性引起了广泛关注，已有研究表明它们能够调节关键的分子靶标。例如，一种强效的抗氧化剂白藜芦醇通过影响p53和NF-κB信号通路抑制癌细胞生长。此外，还识别并完全表征了多种天然抗氧化剂，包括类胡萝卜素、雌激素、褪黑素、抗坏血酸、生育酚、尿酸、生育三烯酚、谷胱甘肽、辅酶Q10、胆红素、硫辛酸和多酚等。除了天然抗氧化剂，还开发了多种合成自由基清除剂，这些合成剂通常受到天然模板的启发，并正在通过细胞和分子模型评估其在对抗ROS诱导的细胞损伤方面的有效性。

合成氨基酸及其衍生物，包括由蛋白质生成氨基酸如L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-亮氨酸衍生的类胡萝卜素，具有多种生物活性，包括抗氧化活性。有趣的是，探索新的方法以应对重大健康挑战包括研究能够与核酸和蛋白质相互作用的分子系统，这些系统包括氨基酸衍生的、肽和寡核苷酸衍生物，以及混合结构如核肽。这些研究进一步揭示了合成氨基酸在生物医学研究中的应用潜力。

在材料与方法部分，我们详细描述了所使用的材料，包括二甲基亚砜（DMSO）、(9H-芴-9-基)甲基（2,5-二氧代吡咯烷-1-基）碳酸酯（Fmoc-OSu）、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、环己烷、甲醇、氢氧化钠、硫酸钠、盐酸、氨水等。所有化学物质均从商业供应商处获得，并在使用前未进一步纯化。溶剂在使用前进行了新鲜蒸馏处理。薄层色谱（TLC）使用了默克公司的铝基板，预先涂布了0.2毫米的Kieselgel 60 F254（德国达姆施塔特）。柱色谱使用了硅胶（60×120目）在玻璃柱中进行。

质子（¹H）和碳-13（¹³C）核磁共振（NMR）光谱在Varian Mercury 300 MHz光谱仪上记录，以四甲基硅烷（TMS）为内标（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）。熔点使用电热装置（Bibby Scientific，英国Stone）测量。质谱（MS）使用Shimadzu LC-MS-2020系统，在正离子模式下进行电喷雾电离（ESI）。数据通过LabSolutions软件（日本京都Shimadzu）处理。红外光谱（IR）使用IRTracer-100仪器（日本京都Shimadzu）在KBr棱镜上获得，波数范围为4000–350 cm^?1，分辨率为4 cm^?1。元素分析使用EURO EA 3000分析仪进行。对映体纯度通过高效液相色谱（HPLC）使用Waters Alliance 2695系统，以Diaspher-110-Chirasel-E柱（6.0 μm，4.0×250 mm）在20%甲醇和80%0.1 M NaH?PO?溶液的流动相中测定。旋光度使用Perkin Elmer-341偏振计测定。

在合成与表征部分，详细描述了合成、纯化和表征肽4和5的过程，包括使用支持信息部分的图S1—S12。在CD实验中，光谱的获取方法参考了文献报道。实验在15°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行，pH值为7.4。化合物4和5均以9 mM浓度制备为甲醇溶液。在测量中，使用了1.8×10^?2 nmol的BSA和9 nmol的化合物4和5。对于DNA结合实验，使用了1.54 nmol的DNA和90 nmol的化合物4和5。最终体积在BSA和DNA实验中分别为0.15 mL和0.16 mL，光程为0.5 mm，使用Applied Photophysics石英池进行。每条光谱均取三次扫描的平均值。值得注意的是，通过从自由化合物的光谱中减去，得到了化合物4和5与BSA和dsDNA结合后的CD光谱，确保信号仅反映它们与生物大分子的相互作用。

在DPPH自由基清除实验中，我们使用DPPH作为评估抗氧化活性的指标。DPPH溶液通过将3.94 mg的DPPH溶解于50 mL的无水甲醇中制备，得到0.2 mmol/L的浓度。DPPH溶液通常稳定，并可在制备后几天内使用。样品溶液以无水甲醇制备，浓度范围为12.5 μg/mL至500 μg/mL。合成化合物、氨基酸和标准抗氧化剂如抗坏血酸（维生素C）在不同浓度下测试，以建立其抗氧化活性的剂量-反应关系。抗氧化活性通过计算DPPH自由基的抑制率（%）来确定，使用以下公式：
$$ \text{Inhibition ratio (\%)} = \frac{A_1 - A_2}{A_1} \times 100 $$
其中，A₁和A₂分别代表空白和样品溶液的吸光度。所有测量均重复三次，并在室温（23°C）下进行。除了百分比抑制率外，抗氧化活性还可以通过IC₅₀值来表达，即减少DPPH自由基50%所需的化合物浓度。

在计算机模拟研究部分，我们详细描述了配体的准备过程。首先，通过MolView输入氨基酸4和5的IUPAC名称，获取了它们的SMILES字符串。然后，将这些字符串粘贴到Molinspiration Cheminformatics的免费网络服务中（Slovensky Grob，斯洛伐克；访问日期：2025年5月6日），使用Galaxy 3D结构生成器v2023.08生成3D结构。生成的Molfile文本被保存为.txt文件，并通过Cactus Translator转换为PDB文件（访问日期：2025年5月6日）。随后，使用Discovery Studio Biovia（Discovery Studio (DS) 2021；Accelrys，美国加利福尼亚州圣地亚哥）对PDB文件进行编辑，添加氢原子，并使用CHARMM力场进行能量最小化。

在分子对接研究中，配体结构被上传到HDOCK软件进行盲对接，选择1BNA（ctDNA）或4F5S（BSA）作为靶标PDB ID。为了评估化合物是否可能在BSA单体之间结合，我们使用4F5S PDB条目中的完整二聚体结构进行对接模拟。这一策略旨在探索可能的配体在单体-单体界面的相互作用，这在高浓度环境、如蛋白质聚集、药物制剂或蛋白质-蛋白质相互作用研究中可能具有相关性。然而，如本研究其他部分所述，我们的结果一致表明，结合发生在单个单体链内，没有在二聚体界面或两个亚基之间检测到显著的相互作用。分子对接研究是预测化合物药理和生物特性的重要工具，它们提供了关于结合亲和力、相互作用位点和分子层面潜在作用机制的见解。

在CD光谱解卷积部分，我们使用CD3软件（访问链接：http://lucianoabriata.altervista.org/jsinscience/cd/cd3.html，访问日期：2025年5月6日）分析CD光谱。CD信号值（以mdeg为单位）和对应的波长（以nm为单位）被输入到该工具中。实际上，CD光谱中二级结构含量的变化是通过将mdeg转换为平均残基椭圆度来估算的。有关CD分析的更多细节可在该链接中找到。仅考虑具有正系数值的光谱区域用于二级结构分析。选择了“Fit alpha beta coil”选项，并手动调整了α-螺旋、β-折叠和随机卷曲的系数（使用+/?按钮），以使预测曲线与实验光谱视觉对齐。最终的系数用于进一步计算和解释蛋白质的二级结构含量。

研究结果部分显示，我们介绍了两种合成氨基酸的多个特性，这些氨基酸首次在本研究中合成。从合成角度来看，一种新型的非蛋白质生成氨基酸，即（S）-2-氨基-3-(4-氧-4,6-二氢-3H-螺[苯并[h]喹唑啉-5,1′-环己烷]-2-基)-丙酸，通过使用基于螺[苯并[h]喹唑啉]的烷基化试剂对Ni(II)-（S）-BPB-Gly复合物进行烷基化合成。反应在碱性条件下的DMF中顺利进行，产物在中和和纯化后通过硅胶柱色谱分离。接下来，目标氨基酸4通过使用之前开发的标准方法从相应的复合物3中分离出来，通过在2 M HCl/MeOH回流混合物中的酸性分解实现。值得注意的是，这种情况下获得的非天然氨基酸3在分解后直接从反应混合物中沉淀出来，这得益于氨基酸的疏水性，使整个过程更加实用和有用，避免了离子交换柱的使用。从乙醇-水混合物中重结晶提供了分析纯材料，适合进一步修饰。此外，重要的优势在于，可以通过过滤和/或萃取以对映体纯形式分离出手性辅助配体，并可重复用于新一批的甘氨酸Ni(II)复合物的合成。随后，我们关注了Fmoc保护的非天然氨基酸5的合成。通过在碳酸盐缓冲液和二氧烷系统中使用Fmoc-OSu对合成的氨基酸进行保护，形成了相应的Fmoc衍生物5。所需产物通过从3/1乙酸乙酯/己烷溶液中沉淀获得。通过¹H和¹³C NMR光谱学、IR、HPLC和ESI-MS确认了自由氨基酸和Fmoc保护衍生物的结构和纯度。

在抗氧化性能研究中，我们使用了初始烷基化试剂2作为内部参考，因为它通常具有抗氧化特性，研究了合成的非蛋白质氨基酸4和其Fmoc保护形式5的抗氧化性能。为了比较，使用了等摩尔浓度的维生素C溶液作为对照。通过与稳定的自由基1,1-二苯基-2-苦肼（DPPH）的相互作用，确定了化合物的还原能力。对于研究的化合物，DPPH清除活性在0.1–0.8 mM的浓度范围内评估，具体取决于化合物的溶解性和初步活性观察。DPPH清除与化合物浓度之间的关系如图1所示。通过DPPH实验数据获得的线性回归方程用于计算IC??值。结果数据如表1所示。

在讨论部分，我们强调了这些合成氨基酸在生物医学中的多重功能。它们不仅与生物大分子相互作用，还表现出抗氧化活性，这表明它们可能在减轻由其他合成物（如化疗药物、环境毒素或工业污染物）引起的氧化应激方面发挥重要作用。通过清除自由基，化合物4和5可能有助于在合成物诱导的应激下维持生物分子的完整性及细胞功能。它们与血清白蛋白的相互作用还为药物输送系统提供了潜在应用，尤其是在促进药物运输和控制释放方面。此外，通过配体诱导的构象变化，调节蛋白质结合口袋的可能性也是值得考虑的一个方面。总体而言，本研究的结果突显了人工氨基酸作为合成物的多功能性，不仅能够与生物大分子相互作用，还可能在治疗和调控应用中具有潜力。它们的结构、结合、抗氧化和自由基清除特性使其成为生物医学和药理学领域进一步研究的有前景候选物。