茶叶发酵过程中真菌群落演替规律及其对品质形成的影响机制研究

《LWT》：Fungal Community Succession in the Fermentation of Black and Oolong Teas

本研究针对茶叶发酵过程中真菌群落动态变化机制不清的问题，通过多基因座（ITS1、ITS2、LSU）扩增子测序技术，系统解析了乌龙茶和红茶发酵过程中的真菌群落演替规律。研究发现发酵过程驱动真菌群落从Pleosporales主导向Capnodiales主导的确定性演替，内生真菌构成发酵核心功能群，且红茶延长发酵形成更紧密的菌群互作网络。该成果为精准调控茶叶品质提供了微生物生态学理论基础。

　　

茶作为世界上最受欢迎的饮品之一，其独特的风味品质主要取决于加工过程中的发酵程度。传统上茶叶按发酵程度分为不发酵（绿茶）、部分发酵（乌龙茶）和完全发酵（红茶）三大类，每种茶类都呈现出截然不同的色泽和风味特征。这些风味差异主要来源于茶叶中儿茶素、酚酸等植物化合物的生物化学转化，而转化过程并非单纯由植物自身完成，微生物群落特别是真菌在其中扮演着关键角色。

尽管微生物在茶叶发酵中的重要性已得到认可，但现有研究多集中于细菌群落，特别是普洱茶等后发酵茶中的细菌作用。相比之下，真菌群落的研究相对匮乏，且多数研究聚焦于后发酵茶的晚期发酵阶段。然而，新兴证据表明真菌可能在乌龙茶和红茶等初始发酵阶段发挥着比以往认知更为关键的作用。茶叶发酵过程中真菌群落的演替动态及其对最终品质形成的影响机制仍不明确，这一知识缺口限制了我们将特定真菌动态与两种世界最流行茶类的最终品质和感官属性相联系的能力。

为填补这一关键空白，研究人员开展了一项创新性研究，通过多基因座DNA条形码技术，系统解析了部分发酵（乌龙茶）和完全发酵（红茶）茶叶生产过程中真菌多样性和群落结构的变化。该研究旨在识别驱动这些变化的关键真菌类群，区分叶片内生真菌与加工过程中引入真菌的作用，并比较两种茶类真菌共现网络的差异，揭示群落互作的变化规律。

关键技术方法包括：从同一批鲜叶原料分别进行乌龙茶和红茶加工，在原料、萎凋和发酵三个关键阶段采样；使用ITS1、ITS2和LSU三个真菌DNA标记区域进行扩增子测序；通过OTU聚类、Alpha和Beta多样性分析、LEfSe差异丰度分析以及共现网络构建等方法系统解析真菌群落动态。

研究结果揭示了茶叶发酵过程中真菌群落的显著变化。在群落组成方面，真菌群落呈现明显的确定性演替模式，从鲜叶阶段以Pleosporales为主导向发酵阶段以Capnodiales为主导转变。具体而言，在ITS1数据集中，Pleosporales在原料中占79%-85%，萎凋期降至11%-44%，发酵期稳定在19%-40%；而Capnodiales从原料中的15%-19%上升至萎凋期的42%-82%，并在最终发酵阶段保持41%-67%的高比例。同时，Tremellales从初始的0.1%-0.3%上升至萎凋期的4%-9%，发酵期维持在3%-9%。

多样性分析显示，真菌Alpha多样性在发酵过程中显著增加。发酵叶的Shannon、Chao1和Inverse Simpson指数均显著高于原料，但完全发酵与部分发酵茶之间的最终Alpha多样性无显著差异。Beta多样性分析表明，真菌群落结构在茶叶加工阶段间发生显著变化，主坐标分析清晰区分原料、萎凋和发酵三个阶段，且完全发酵与部分发酵叶在第二轴上分离。

关键发现是，发酵过程中的主要真菌来源于鲜叶初始菌群。来自原料的OTU占萎凋叶群落丰度的92%（红茶）和95%（乌龙茶），占发酵叶的91%（红茶）和87%（乌龙茶）。持续性指数分析进一步证实，最终发酵阶段最丰富的真菌绝大多数来源于在三个阶段均存在的持久性OTU集合。

LEfSe分析识别出22个在发酵过程中显著富集的属，其中11个属（如Cladosporium、Papiliotrema、Alternaria等）在两种茶过程中共同富集，而乌龙茶和红茶分别特异性地富集7个和4属。共现网络分析显示，红茶发酵网络具有显著更高的模块间连接度，表明延长发酵时间使真菌群落互作更加紧密和整合。

讨论部分深入分析了研究发现的理论与实践意义。研究表明茶叶发酵是一个由叶片内生真菌群落驱动的生态过程，发酵过程触发了真菌从活叶中的休眠内生菌向组织衰老后的活跃分解者的生态角色转变。核心真菌类群如Pleosporales和Capnodiales通过产生胞外酶降解茶叶中的复杂底物，直接影响茶的最终风味和香气。同时，Xylariales等后演替真菌在发酵后期变得代谢活跃，参与更复杂植物聚合物的分解。

研究还发现，虽然发酵过程中真菌多样性增加且环境真菌明显流入，但生态轨迹保持稳定，因为原始内生类群在整个发酵过程中约占群落总丰度的90%。这表明环境真菌贡献了物种丰富度，但核心功能角色主要由适应性强的居民群落主导。发酵时间的长短是塑造最终群落结构的关键因素，红茶较长的发酵时间作为扩展的选择过滤器，使某些后演替真菌更加突出，并加强了群落互作。

该研究发表在《LWT》杂志，为理解茶叶发酵的微生物生态学机制提供了新视角。研究结果表明发酵是一个强大的生态过滤器，同时通过选择优势类群来塑造群落组成，并通过简化网络结构来重组群落相互作用。这种双重影响为理解和潜在调节茶叶及其他发酵食品的微生物生态提供了新框架，对精准调控茶叶品质、提升产品一致性和创新加工工艺具有重要指导意义。