液态及包封形式的浮萍（Lemna minor L.）提取物在包装牛肉汉堡的保质期内会对其代谢组特征产生不同的影响

《Meat Science》：Liquid and encapsulated duckweed ( Lemna minor L.) extracts differentially shape metabolomic fingerprints of packaged beef burgers during shelf life

本研究评估了浮萍（Lemna minor）液态提取物及阿拉伯胶、麦芽糊精包埋形式作为肉制品天然抗氧化剂的效果。通过物理化学、微生物学和代谢组学分析发现，1%液态提取物和0.1%包埋提取物（阿拉伯胶）能有效抑制脂质氧化，维持肉色稳定至7天，且高剂量包埋可能导致氧化。代谢组学显示抗氧化机制涉及谷胱甘肽代谢、血红素螯合及脂质氧化中间产物的减少，分子对接证实咖啡酸与肌红蛋白结合可抑制氧化。研究证实浮萍提取物可持续替代合成防腐剂，最佳应用浓度为液态1%（w/w）和包埋0.1%（w/w）。

　　### 鸭weed提取物作为天然抗氧化剂在新鲜牛肉汉堡中的应用

近年来，食品工业在寻找天然抗氧化剂方面投入了大量精力，旨在替代合成防腐剂，推动可持续发展。植物来源的生物活性化合物，如鸭weed（*Lemna minor*），因其丰富的多酚类、黄酮类、酚酸类（如咖啡酸）和类胡萝卜素等成分而受到关注。这些化合物具有显著的抗氧化作用，并在清除活性氧（ROS）和螯合促氧化金属离子方面发挥关键作用。然而，直接将鸭weed应用于肉类产品仍面临挑战，因为其生物活性成分易受氧化、光照和热应力影响。因此，微胶囊化技术成为一种有效手段，以提高植物抗氧化剂的稳定性、生物利用度和可控释放。

#### 植物材料与鸭weed液态提取物（LLE）的制备

本研究基于先前的响应面法（RSM）研究，确定了鸭weed的收集、生长和提取条件。LLE的制备在意大利的Università Cattolica del Sacro Cuore进行。简要而言，将1克干燥的鸭weed组织在100毫升溶剂中进行超声波辅助提取（UAE），提取时间为15分钟，设定温度为50摄氏度，功率为120瓦，溶剂为50%乙醇。提取后，样品通过PT1200E（Polytron）搅拌机进行均质化，并在4摄氏度下离心10分钟（6000×g）。上清液随后通过0.22微米注射器过滤器过滤，并用真空旋转蒸发器（55摄氏度，30分钟）去除乙醇，最后用蒸馏水恢复至原始体积。整体而言，提取过程提供了约220毫克干燥提取物每克干燥植物材料的平均产率，即约22%（w/w）。

#### 鸭weed提取物与阿拉伯胶和糊精的微胶囊化

微胶囊化过程在意大利的Clever Bioscience Srl进行。简要而言，将20克干燥的鸭weed生物质在2升50%乙醇中进行超声波提取，提取时间为15分钟，功率为300瓦，占最大功率的65%，每50秒激活一次，共10秒。提取后的混合物在5摄氏度下离心两次，每次15分钟，以最大化植物化学物质的回收。随后，将乙醇在真空条件下通过旋转蒸发器去除，并将50克阿拉伯胶（OENO? Kordofan）和50克糊精（GLUCIDEX? 19；葡萄糖当量=19）分别溶解在500毫升浓缩提取物（10% w/v）中，并在磁力搅拌下进行30分钟，以确保完全溶解。载体比例基于初步试验和文献选择，以确保适当的微胶囊化效率和粉末稳定性。使用Pilotech YC-018实验室喷雾干燥机进行喷雾干燥，该设备具有3500毫升/小时的额定容量和2立方米/分钟的额定空气流量。该装置配备双流喷嘴（标准喷嘴1.5毫米）并使用仪器的压缩空气供应（32升/分钟，0.5–2巴）。入口空气温度设定为130摄氏度，出口温度为67摄氏度，泵速固定为20转/分钟，自动防堵塞系统每10秒激活一次。进料速率（毫升/小时）取决于进料特性，并通过泵速控制；在所有实验中，泵速保持不变，以确保一致的处理条件。

#### 生物活性化合物的微胶囊化产率评估

总生物活性化合物和表面生物活性化合物的测定基于Saénz等人（2009）的方法，并进行了小幅修改。简要而言，为了量化生物活性化合物，将100毫克微胶囊化粉末分散在1毫升乙醇、乙酸和水（50:8:42）中，涡旋1分钟，随后在120瓦和室温下超声处理40分钟。离心后（最大速度，10分钟），上清液通过0.22微米注射器过滤器过滤，并用Folin-Ciocalteu（FC）法测定生物活性化合物，通过估算总还原当量（以没食子酸当量，GAE表示）。FC法可以测量总还原能力，但由于它可以与其他还原物质（如抗坏血酸或某些氨基酸）反应，因此其值不能完全代表酚类分子的绝对总和。因此，FC值被视为提取物还原/抗氧化池的指标，而不是酚类分子的绝对总和。此外，对于表面生物活性化合物，将100毫克微胶囊化粉末与1毫升乙醇和甲醇（1:1）混合，涡旋1分钟，随后通过0.22微米注射器过滤器过滤。再次使用FC法进行定量分析。表面生物活性化合物百分比（SB）和生物活性化合物微胶囊化产率（BMY）根据公式（1）和（2）计算：

$$ SB\% = \frac{表面生物活性化合物}{总生物活性化合物} \times 100 $$

$$ BMY\% = 100 - SB\% $$

微胶囊化产率在阿拉伯胶（81%）和糊精（79%）中均较高，表明这两种载体均能有效包埋生物活性化合物。然而，它们在肉质基质中的释放行为可能不同，因为阿拉伯胶的较高分子量和复杂分支结构可能导致较慢、更可控的释放，而糊精的高溶解性可能导致多酚更快释放。这些可控释放行为对于肉制品应用尤为重要，因为需要在储存过程中延长抗氧化作用。影响微胶囊化系统性能的因素包括核心与包覆材料的比例、糊精的葡萄糖当量（DE）、载体在肉质基质中的溶解性以及喷雾干燥过程中的入口温度。

#### LLE和微胶囊化提取物（AGL和ML）的体外抗氧化潜力

体外抗氧化活性的评估使用了互补的实验方法，包括DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP和金属螯合活性。三种独立批次的每种提取物（LLE、AGL、ML）均进行了准备和分析，使用不同的抗氧化实验方法。Trolox当量（TE）用于DPPH、ABTS自由基清除、CUPRAC和FRAP实验。金属螯合活性则通过EDTA当量（EDTAE）进行测定。完整的实验细节可在之前的科研文章中找到（Grochowski等，2017）。

#### 在MAP条件下新鲜牛肉汉堡的储存期研究

牛肉汉堡由Indal S.r.l.（意大利蒙蒂卡里，布雷西亚）生产，储存过程在Università Cattolica del Sacro Cuore（意大利克雷莫纳）的肉类试点工厂进行。三个独立的肉糊，每个重13.2千克，分别在不同日期准备。配方由98.8%的牛肉肉（银侧和顶侧切口，含约5%脂肪）和1.2%的盐（NaCl）组成。肉通过工业绞肉机（Risco，意大利蒂埃内）进行绞碎，配备4毫米孔板，随后使用工业搅拌机（Risco，意大利蒂埃内）加入盐。准备好的肉混合物，盐均匀分布在其中，根据研究设计分为11个实验批次：CTR-（阴性对照，仅含1% NaCl，无添加剂）、CTR+（阳性对照，含1克/千克抗坏血酸，加上1% NaCl）、LLE 0.1%、LLE 0.5%、LLE 1%（鸭weed提取物分别以1、5、10克/千克添加）、AGL 0.1%、AGL 0.5%、AGL 1%（鸭weed提取物用阿拉伯胶微胶囊化，分别以1、5、10克/千克添加）、ML 0.1%、ML 0.5%、ML 1%（鸭weed提取物用糊精微胶囊化，分别以1、5、10克/千克添加）。所有提取物浓度（0.1%、0.5%、1% w/w）均以肉为基准，即相对于肉糊形成前的绞碎牛肉总质量。每个批次通过行星搅拌机（Kenwood Major Pro）单独混合，确保均匀性，混合时间为5分钟，中速确保液态和粉末提取物的均匀分布。随后，使用汉堡压机手动成型汉堡，每只汉堡重100克。随后，每个汉堡在聚丙烯热封托盘中进行包装，模拟超市条件，形成66%氧气（O?）、25%二氧化碳（CO?）和9%氮气（N?）的改良大气包装（MAP）。包装样品在4摄氏度下储存，并暴露于光照下。选择的高氧MAP（66% O? / 25% CO? / 9% N?）反映了零售展示条件，通常用于维持牛肉的红色（Djenane & Roncalés, 2018），同时也提供了评估抗氧化效果的氧化环境。采样在储存1天（T1）、7天（T7）和14天（T14）后进行。总共生产了396个汉堡样品，对应四个处理×十一处理×三个储存时间×三个独立复制（在不同日期进行，使用不同的生肉批次，但相同的成分组成）。

#### 微生物、pH、水活度（aw）和气体组成分析

微生物评估遵循ISO方法对每组微生物进行评估。十倍稀释后在选择性生长培养基（Oxoid，意大利米兰）上进行平板培养，并根据ISO标准进行培养：a）总微生物数（TMC）用于嗜冷菌和中温菌，分别在7摄氏度下培养10天和在30摄氏度下培养72小时；b）乳酸菌（LAB）在无氧条件下培养在MRS培养基上，37摄氏度下培养48小时（ISO 15214:1998）；c）葡萄球菌在含有蛋黄碲化物乳液的Baird Parker培养基上培养，37摄氏度下培养48小时（ISO 6888-1:2018）；d）肠杆菌科在VRBGA培养基上培养，37摄氏度下培养24小时（ISO 21528-2:2017）；e）酵母菌在含有氯霉素（100毫克/升）的Rosa Bengal培养基上培养，30摄氏度下培养4天。微生物计数以Log CFU/g表示。

pH测量通过将电极插入每个样品的-1稀释液中进行。校准使用pH 4.01和7.00的缓冲液，在22摄氏度下进行。水活度（aw）在25摄氏度下使用AQUALAB 4TE aw计（Decagon Devices, Inc., Pullman, WA, USA）进行测量，遵循ISO程序（ISO 18787:2017）。pH和aw测量在每个采样点（n=3）进行三次重复。

最终，MAP气体组成的评估通过在每个采样点（T1、T7和T14）使用头空间气体分析仪进行CO?和O?百分比值的测量，用于MAP质量控制的Dansenor CheckMate 3（Ametek Mocon, Ringsted, Denmark）。

#### 颜色分析和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）实验

颜色测量在每个批次的采样点（n=3）进行三次重复，使用HunterLab D25 NC色度计（HunterLab, Reston, Virginia）进行，采样后遵循30分钟的膨胀时间。结果记录在CIELab*色度空间中，使用D65光源，孔径大小为25.4毫米，10°观测角。三维颜色参数包括L*（明度），其中L*=0代表黑色，L*=100代表白色；a*，其沿红绿轴测量色度（-a*代表绿色度，+a*代表红度）；以及b*，其代表蓝黄轴（-b*代表蓝色度，+b*代表黄色度）。此外，总颜色差异（ΔE*）根据Biró等（2019）的方程进行计算。

脂质氧化通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）实验进行评估，遵循Vyncke（1975）的方法，进行小幅修改。结果以每千克样品的丙二醛（MDA）毫克数表示，基于三个独立的重复（n=3）。

#### 未靶向代谢组学分析的肉代谢物

肉代谢物的提取基于Rocchetti等（2023）的报告。汉堡样品（1克）用80%甲醇（v/v）稀释10倍，并用0.1%甲酸酸化，随后使用PT1200E（Polytron）均质器提取。提取物在4摄氏度下离心（6000×g，15分钟），并过滤通过0.22微米纤维素注射器过滤器，装入UHPLC样品瓶中。使用Q-Exactive? Focus混合四极杆-轨道阱质谱仪（Thermo Scientific, USA）进行UHPLC-HRMS分析，与Vanquish UHPLC系统耦合，使用HESI-II探针。流动相为水和乙腈（LC-MS级，Sigma-Aldrich）与0.1%甲酸，按照梯度洗脱从6%到94%乙腈在35分钟内进行。分离在ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1×100毫米，1.7微米）上进行，温度为35摄氏度。全扫描MS（m/z 80–1200）在正离子化模式下进行（70,000分辨率在m/z 200），流速为200微升/分钟，注射体积为6微升。质量控制（QC）样品随机注入，并在数据依赖模式下进行MS/MS分析（Top N=3），评估可重复性，分辨率在m/z 200为17,500，23.3电子伏特为归一化碰撞能量。数据使用MS-DIAL（版本4.90）进行处理，包括峰检测、LOWESS归一化和代谢物注释通过光谱匹配与FooDB。完整的软件参数和识别工作流程在Rocchetti等（2021）中报告。注释基于质量准确性、同位素轮廓和光谱匹配，达到COSMOS代谢组学标准的第二级信心（García-Pérez等，2024）。

#### 在硅计算研究中：重点在咖啡酸

随后，基于“AutoDock Vina”和“吸引腔体”的硅计算研究在SwissDock（Bugnon等，2024）上进行，以研究咖啡酸与肌红蛋白蛋白（UniProt ID: P02192）的主要相互作用。特别是，配体-蛋白相互作用的结合自由能（deltaG）和亲和力，以及其他因素（如配体溶解性、脱溶化能量和整体生理化学兼容性）通过检查AC分数和SwissParam分数值进行评估。

#### 统计分析

不同鸭weed提取物和包覆剂（LLE、AGL、ML、AG粉末、M粉末）的体外抗氧化活性值使用R（版本4.4.1）进行分析。使用线性混合效应模型（lmer）计算估计边际均值（EMMs），提取物类型作为固定因子，批次作为随机因子。均值的标准误差（SEM）值从每个模型的残差方差中推导，显著差异通过配对比较与紧凑字母显示分组（CLD）方法确定（P<0.05）。其他参数（pH、aw、微生物计数、MAP气体、L*、a*、b*和MDA值）使用IBM SPSS Statistics（版本26.0）进行双因素方差分析（ANOVA），考虑储存时间和处理作为固定因子，而制造重复作为随机因子。当ANOVA显示显著性（P<0.05）时，应用Duncan的后验检验来确定均值之间的差异。固定因子之间的交互作用也进行了分析。

对于未靶向代谢组学，数据处理使用多种软件工具，包括Mass Profiler Professional B.12.06（Agilent Technologies）、SIMCA 13（Umetrics）和MetaboAnalyst 6.0。原始UHPLC-HRMS数据进行了中位数中心化、log10转换和Pareto归一化。基于欧几里得距离的分层聚类分析（HCA）用于无监督聚类，而监督分类使用正交投影到潜在结构判别分析（OPLS-DA），储存时间作为判别因子。有关验证和置换测试的详细信息可在Rocchetti等（2023）中找到。关键判别代谢物使用变量重要性在投影（VIP）算法（阈值>1）进行识别，其变化通过倍数变化（FC）分析（阈值>1.2）使用Mass Profiler Professional软件进行分析。此外，使用R-Studio中的“rAMOPLS”包（版本0.2）进行多因素方差分析与OPLS预测建模（AMOPLS）以更好地评估储存时间和处理之间的潜在相互作用。模型随后通过不同的参数进行统计和预测评估，如残差平方和（RSS）、基于残差结构比的P值（RSR P值）和拟合度（R2Y）。

#### 结果与讨论

##### 植物化学成分和LLE与微胶囊化提取物的体外抗氧化潜力

UHPLC-HRMS分析确认，液态L. minor提取物（LLE）富含多酚，总含量为3340微克当量（Eq.）/克（补充表1）。具体而言，提取物含有1826微克Eq./克的酚酸，1065微克Eq./克的黄酮，401微克Eq./克的其他多酚（包括木脂素、酪醇和香豆素），以及47.1微克Eq./克的 stilbenes。其中，咖啡酸和羟基咖啡酸是主要成分，与先前对Lemna物种的报告一致（Baek等，2021；Del Buono等，2022；Petrova-Tacheva等，2020；Zhang等，2023）。

线性混合效应模型确认，所有实验中提取物的体外抗氧化潜力存在显著差异（表1），同时考虑批次间的变量。对于DPPH和ABTS自由基清除，LLE提取物显示出最高的活性（47.71和68.44毫克TE/克），显著优于微胶囊化（AGL、ML）和仅包覆剂的对照（AG和M粉末）。类似的趋势在CUPRAC和FRAP实验中观察到，其中LLE和AGL表现出最高的还原能力，表明液态提取物和阿拉伯胶微胶囊化保留了更高的抗氧化能力。金属螯合活性遵循相同的模式，LLE（23.43毫克EDTAE/克）显示出最强的效果，突出了其广谱抗氧化潜力。这些发现表明，鸭weed提取物的体外抗氧化能力受到提取形式和微胶囊化类型的影响，同时通过混合模型方法成功控制了批次效应。有趣的是，在测试条件下，阿拉伯胶微胶囊化比糊精微胶囊化更有效地保留抗氧化能力，这主要体现在FRAP值（表1）中。这些结果与先前研究一致，表明由于其复杂的分支结构和良好的乳化特性，阿拉伯胶形成了一种更稳定的基质，更好地保护多酚免受氧化和降解（Rezende等，2018；Smaoui等，2021）。纯多糖粉末本身显示出最小的抗氧化干扰（表1），确认观察到的活性是由于鸭weed提取物本身。

##### 储存期间牛肉汉堡的aw、pH和微生物计数变化

aw的分析显示储存期间有轻微但显著的变化（表2）。总体而言，aw范围从0.9880到0.9995，T14时略有增加，可能由于pH接近肌原纤维蛋白的等电点（Kowalczyk等，2024）。这与报告一致，氧化和蛋白水解可能导致肌肉蛋白的结构变化，影响水分迁移（Kowalczyk等，2024）。测量的aw值确认最大提取物添加（即1% w/w）没有显著改变样品的水合度，因此观察到的处理差异可能归因于提取物及其载体，而不是不同水分含量的差异。

微生物分析显示鸭weed处理没有抗菌效果（表2）。总中温菌数（TMC）随时间增加，范围从6到7 log CFU/g，符合MAP储存新鲜肉的典型情况。嗜冷菌在7摄氏度下占主导地位，而乳酸菌（LAB）从T1的约4 log CFU/g逐渐增加到T14的约5 log CFU/g，与pH下降一致。没有处理抑制LAB生长，表明酚类含量和抗氧化活性不足以在这些条件下产生抗菌效果。这与先前研究一致，表明富含多酚的提取物用多糖微胶囊化通常对氧化而非微生物稳定性有更大影响（Pilatti-Riccio等，2019）。葡萄球菌保持在3 log CFU/g以下，表明污染程度较低（补充表3），与Kowalczyk等（2024）的报告一致，他们评估了真空和MAP包装的牛肉的微生物质量。肠杆菌科的计数在储存期间下降，可能由于MAP和pH下降，而酵母菌保持在较低水平（<2.5 log CFU/g），确认MAP的高CO?控制了其生长（补充表3）。这些微生物动态确认观察到的氧化稳定性改善和颜色变化应主要归因于微胶囊化提取物的抗氧化作用，而不是抗菌效果，如Sirini等（2025）在封装的猕猴桃皮提取物上的研究也观察到类似结果。我们的发现与Najjaa等（2020）的报告不同，他们评估了用阿拉伯胶和糊精微胶囊化的大蒜精油对牛肉质量的影响，并发现其对质量有显著的抗菌效果，这可能归因于硫化物的丰富性。这表明不同植物基质的关键活性化合物发挥着重要作用。因此，我们的结果暗示，虽然微胶囊化策略有效地调节氧化和pH趋势，但其对腐败微生物的控制不足以延长保质期，因此应与严格的卫生措施和适当的MAP条件结合，以确保储存期间的微生物安全。

##### 储存期间牛肉汉堡的颜色、MDA和MAP气体组成变化

颜色参数、TBARS和MAP气体组成分析揭示了LLE及其微胶囊化形式（AGL和ML）对牛肉汉堡氧化稳定性和外观的影响（图1）。特别是，处理与储存时间之间的显著交互作用（P<0.001）被发现。因此，在所有处理×时间组合中进行了均值比较。根据Duncan检验（P<0.05）识别了显著差异，如表3所示。总体而言，新鲜肉（在汉堡制作和包装前）的MDA含量未检测到，确认新鲜绞碎牛肉中氧化过程的预期缺失。在一天后（T1），所有样品显示出鲜艳的红色，确认了MAP的初始保护作用。然而，明显的差异出现：CTR+显示出最高的红度（a*=18.87）和最低的脂质氧化（MDA=0.14毫克/千克），而LLE 1%改善了红度（a*=17.93）并适度降低了MDA水平。在微胶囊化形式中，AGL 0.1%在红度（a*=17.40）和氧化控制（MDA=0.78毫克/千克）上表现出平衡效果，而ML 1%表现不佳，显示出低红度和高MDA，表明在高剂量下抗氧化释放不理想。到第七天（T7），氧化劣化变得更加明显，CTR-显示出最严重的褪色（a*=3.89）。LLE 1%保持最高的红度（a*=11.39）和最低的MDA倍数增加，确认其抗氧化效果。低剂量微胶囊化处理（AGL 0.1%、ML 0.1%）也比高剂量表现出更好的颜色和氧化抑制，这可能归因于更可控的抗氧化释放。相反，高浓度导致MDA增加和红度损失，这可能由于过量的多酚促氧化活性（Procházková等，2011；Rocchetti等，2023）。与阿拉伯胶相比，糊精的更快释放可能对这些效果有所贡献，而阿拉伯胶的乳化特性使抗氧化释放更缓慢。到第十四天（T14），没有处理有效保持红度，且在去除包装后检测到异味。所有样品显示出高级肌红蛋白氧化（a*<3.3），但MDA值较低。T14时MDA值的下降与T7时所有处理相比，尽管看起来有些反直觉，但与脂质氧化的已知动态一致。在初始的初级和次级氧化产物积累后，后续反应可能导致其转化为不反应的化合物。因此，该实验可能低估了肉在后期储存时间的氧化状态。这一解释进一步得到以下代谢组学数据的支持，这些数据突出了T14时向更复杂的脂质氧化产物的进展。因此，MDA值的下降不应被解释为氧化稳定性的改善，而是由于测量自由、TBA反应性MDA的方法学局限性。T7因此是评估处理效果的关键时间点，因为氧化过程在此之后变得主导。查看科学文献中的类似研究，使用糊精和喷雾干燥的接骨木微胶囊化提取物（EE）已被评估为对抗脂质和蛋白氧化的牛肉汉堡延展剂，在MAP条件下（80% O?和20% CO?）的13天保质期（5%脂肪含量）（Rocchetti等，2022）。作者显示，EE在2.5和5克/千克的添加水平能够显著降低MDA水平，与对照样品相比，在T13时达到2.570和2.029毫克MDA/千克，从而克服了接受的劣化水平。

#### 使用多变量统计分析区分储存期间的牛肉汉堡

UHPLC-HRMS代谢组学假定注释了3126种化合物，其中246种通过MS/MS确认（补充表4）。分层聚类分析（HCA）显示储存时间是驱动代谢物谱变化的主要因素（补充图1）。在T1时，样品独立于T7和T14，表明代谢变化随时间增强。处理也在每个储存组内影响代谢组学模式。特别是，在T1时，CTR+样品显示出较低的代谢物丰度（主要在热图上为蓝色阴影），反映了抗坏血酸的抗氧化效果。鸭weed处理的样品显示出较高的代谢物水平，这与多酚含量一致。到T7和T14时，代谢物丰度进一步增加，反映了正在进行的氧化和生化过程。主成分分析（PCA）确认了这些趋势（补充图1），显示三个不同的簇对应储存时间。T7和T14之间的分离不明显，表明在延长储存期间某些稳定化或生化通路的非线性进展。

此外，AMOPLS分析（补充表5）清楚地表明，研究中考虑的所有实验因素，即处理（T）、储存时间（SP）及其交互作用（T×SP），显著贡献于牛肉汉堡样本中的总体代谢物变化（P<0.01对所有因素）。其中，SP显示出最高的相对解释变化（RSS=26.1%），确认储存时间对肉代谢组的强烈影响。有趣的是，T因子单独解释了12.0%的总变化，而T与SP的交互作用解释了17.6%的方差。这表明鸭weed提取物对牛肉代谢组的影响强烈受到储存时间的调节，强调了同时评估这两个因素的重要性。显著的交互作用也与生化参数的双因素ANOVA结果一致，支持了在SP背景下解释T效应的必要性。总体而言，残差方差适中（44.3%），反映了在肉样本的生物特性和未靶向UHPLC-HRMS方法下可接受的实验变化。得分图成分（补充表5）进一步显示，每个因素的主要预测项对模型区分贡献显著（R2Y值>97%），而正交成分捕捉了残差结构变化，表明AMOPLS分解在复杂代谢组学数据集和多因素设计中的稳健性。这些结果表明，鸭weed提取物的抗氧化效应不能脱离储存时间进行讨论，这与基于多个处理水平和时间点的实验设计完全一致。这一结果与我们在相同MAP条件下将液态鸭weed提取物添加到牛肉肉中的先前研究一致（Rocchetti等，2023）。

#### 7天储存期间的代谢物谱和标记化合物

基于AMOPLS结果中显示的显著交互作用，我们随后聚焦于7天储存期间的代谢物谱和标记化合物，其中抗氧化处理仍显示出保持肉红度的能力。因此，这一时间点被视为阐明鸭weed提取物调控的特定代谢通路的最代表性的。图2A（T7）中的热图显示，处理之间形成了两个不同的簇。簇1将CTR-与高剂量微胶囊化处理（ML 0.5%、ML 1%、AGL 0.5%、AGL 1%）分组，表明氧化保护有限。簇2包括低剂量微胶囊化处理（ML 0.1%、AGL 0.1%）和LLE 1%，突出了其更高的抗氧化效果。CTR+形成了一个单独的簇，反映了其短暂的保护效果，如TBARS分析中所示的高MDA倍数增加（9.28）。值得注意的是，低剂量微胶囊化处理（0.1%）表现出与LLE 1%相当的效果，而高剂量微胶囊化处理（1%）与CTR-分组，确认了剂量依赖模式。图3显示了这些结果。

#### 酪氨酸与肌红蛋白的硅结合亲和力和相互作用

鉴于鸭weed提取物中咖啡酸（CA）的高含量（补充表1），我们进行了与肌红蛋白的硅结合研究，以探讨观察到的抗氧化效果的分子基础。CA的抗氧化活性主要归因于其螯合Fe2+离子的能力，从而通过芬顿反应防止羟基自由基的形成。这种螯合作用依赖于pH，最有效在中性pH（约80%在pH 7.2）和在肉质pH（约5.5）下的轻微酸性条件。通过破坏芬顿反应，CA有助于保持氧合肌红蛋白并减少肉的褪色。

因此，硅结合研究（SwissDock，图2）有助于评估CA与肌红蛋白的相互作用。结合自由能（ΔG）为-5.6千卡/摩尔，具有高度有利的AC分数（-27.41千卡/摩尔），表明配体-蛋白亲和力强。SwissParam分数（-6.19）反映了良好的相互作用，尽管有一些溶解度相关的惩罚。CA与肌红蛋白和血红蛋白的结合是已知的，可以抑制肉中的氧化反应（Kassa等，2021；Park等，2013）。其抗氧化作用主要归因于稳定血红素基团，防止血红素从亚铁血红蛋白（metHb）中解离，这一过程会生成自由基并加速脂质氧化。通过与血红素或亚铁血红蛋白结合，CA可以限制氧化损伤，并有助于在储存期间保持肉色（Park等，2013）。在本研究中，我们证明了这种技术作用与在MAP条件下储存14天的处理百分比密切相关。

#### 结论

本研究证明了L. minor提取物在MAP条件下储存的牛肉汉堡中对氧化稳定性和颜色保持有显著影响。液态提取物（1% w/w）和微胶囊化提取物（0.1% w/w）被鉴定为最有效的处理，能在储存7天内保持红度并减少脂质氧化。相反，高浓度的微胶囊化提取物（0.5–1%）效果较差，并在某些情况下诱导促氧化作用，表明过量的多酚释放可能影响氧化平衡。未靶向代谢组学分析确认了这些结果，揭示了氧化生物标志物的调节，包括谷胱甘肽、血红素和色胺，支持了鸭weed提取物在稳定脂质和蛋白氧化通路中的抗氧化作用。未观察到抗菌效果。这些发现表明，鸭weed提取物可以作为可持续、植物来源的抗氧化剂，用于新鲜牛肉汉堡，推荐的使用水平为0.1%（w/w）的微胶囊化形式和1%（w/w）的液态提取物。这代表了在肉类系统中首次展示基于鸭weed的抗氧化剂，提供了一种有前景的合成防腐剂替代方案，并支持肉类工业向清洁标签策略的过渡。