GVII谱系禽冠状病毒IBV-250607GXCX的分离鉴定及其细胞感染特性与致病性研究

《Poultry Science》：A strain of avian coronavirus of the GVII lineage capable of infecting African green monkey kidney cell lines (Vero) and chicken embryo fibroblast cell lines (DF-1)

本研究针对禽传染性支气管炎病毒（IBV）新毒株的细胞适应性机制不清问题，分离鉴定出GVII-1基因型IBV毒株250607GXCX。研究发现该毒株无需鸡胚传代即可高效感染Vero和DF-1细胞，其S基因未发生重组但1b/3a/M/N基因存在重组事件。动物实验表明毒株主要引起呼吸道病变且致病性较低，受体结合分析提示α-2,3-唾液酸转移酶可能非唯一宿主受体。该研究为γ-冠状病毒细胞入侵机制研究提供了理想模型。

　　

在养禽业中，有一种名为鸡传染性支气管炎（IB）的疾病，如同笼罩在养殖场上空的阴云，它由禽传染性支气管炎病毒（IBV）引起，是一种高度传染性的呼吸道疾病。IBV属于γ-冠状病毒家族，其基因组庞大，变异速度快，导致不断有新的基因型（Genotype）和血清型（Serotype）出现。这给该病的防控带来了巨大挑战，因为现有的疫苗往往难以提供针对新流行毒株的交叉保护。更棘手的是，绝大多数野外分离的IBV毒株无法直接在常用的细胞系（如Vero细胞、DF-1细胞）中培养，这极大地限制了对病毒入侵机制、复制周期等基础生物学问题的深入研究。长期以来，经过鸡胚多次传代适应的Beaudette株是少数可用于细胞水平研究的模型毒株，但其经过长期人工适应，与野外毒株存在差异。因此，分离能够直接感染细胞系的野生型IBV毒株，对于揭示IBV的致病机制和开发新型防控工具具有至关重要的意义。

在此背景下，华南农业大学兽医学院的研究团队在《Poultry Science》上发表了一项研究，他们从广西某出现呼吸道症状的肉鸡场中，成功分离到一株新的IBV毒株，命名为IBV-250607GXCX。为了深入解析这株病毒，研究人员运用了一系列关键技术：他们通过接种SPF（无特定病原体）鸡胚进行病毒分离和滴定（EID₅₀测定）；利用Illumina NovaSeq 6000平台进行病毒全基因组测序和组装；基于S1基因和全基因组序列构建系统发育进化树，对病毒进行基因分型；使用RDP5和Simplot软件进行基因重组事件分析；通过细胞病变效应观察、间接免疫荧光（IFA）、Western Blot和实时定量PCR（RT-qPCR）评估病毒在Vero和DF-1细胞中的感染和复制能力；在1日龄和14日龄SPF鸡上进行动物致病性试验，观察临床症状、病理变化、组织病毒载量和抗体产生情况；并利用AlphaFold3人工智能工具预测病毒S1蛋白的三维结构及其与潜在受体（α-2,3-唾液酸转移酶）的相互作用。

分离与鉴定IBV 250607GXCX

研究人员从病鸡气管样品中成功分离到一株IBV。该病毒接种鸡胚后能引起典型的胚胎病变，如发育迟滞。PCR检测确认样品纯净，排除了其他常见禽类病毒的污染。病毒在鸡胚中生长迅速，接种后12小时即达到较高滴度并可持续至72小时。Western Blot检测证实病毒蛋白在鸡胚中有效表达。这些结果表明IBV-250607GXCX是一株能在鸡胚中良好复制的病毒。

S1基因分型鉴定：250607GXCX属于IBV的GVII-1基因型

对病毒全基因组进行测序后，研究人员重点分析了用于病毒分型的S1基因。系统发育分析显示，250607GXCX与2016年报道的I0636/16毒株亲缘关系最近，聚集在同一进化分支上。全基因组进化分析也得出了相同结论。250607GXCX与I0636/16的全基因组核苷酸相似性为96.3%，S1基因相似性为94.7%，且两者具有相同的S蛋白切割位点（HRRKR）。因此，根据S1基因分型标准，250607GXCX被确定为IBV GVII-1基因型。

IBV 250607GXCX的遗传进化分析

为了更精细地了解病毒的遗传特征，研究人员对病毒基因组的各个部分（如1a, 1b, S, 3a, E, M, N等基因）分别进行了进化分析。结果显示，除了3a基因外，250607GXCX的大多数基因都与I0636/16毒株的对应基因亲缘关系最近。这表明I0636/16很可能是250607GXCX的亲本毒株，提示GVII谱系病毒在广西地区已存在并演化了一段时间。

IBV 250607GXCX的基因组特征

病毒全基因组测序分析确认其基因组结构符合典型的IBV特征，即5' UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3' UTR，全长27,698个核苷酸。基因注释和GO（基因本体论）分析提示其编码的蛋白可能参与病毒与宿主细胞的相互作用过程。核苷酸相似性分析进一步证实了250607GXCX与I0636/16的高度同源性，特别是在S基因上。

IBV 250607GXCX的重组分析

病毒重组是冠状病毒进化的重要驱动力。研究人员利用生物信息学软件对250607GXCX的全基因组进行了重组分析。结果发现，病毒的S基因在进化过程中未发生明显的重组事件。然而，在1b基因的3'端、3a基因、M基因、N基因以及部分非编码区检测到了重组信号，这些区域的序列与当地流行的GI-19谱系（如ck/CH/LHLJ/141103）和GI-7谱系（如TW2575/98）毒株有相似性。这表明250607GXCX在进化过程中，其非S基因区域与当地流行毒株发生了基因重组。

IBV 250607GXCX的细胞感染特性

这是本研究的核心发现之一。通常，野生型IBV毒株需要经过几十甚至上百次鸡胚传代才能适应细胞培养。然而，研究人员发现，250607GXCX毒株的鸡胚尿囊液（未经细胞传代）可以直接感染非洲绿猴肾细胞（Vero）和鸡胚成纤维细胞（DF-1），并引起明显的细胞病变效应，如细胞圆缩、聚集和脱落。间接免疫荧光实验显示，250607GXCX感染这两种细胞后，能检测到强烈的病毒蛋白信号，其感染效率与经过150代鸡胚传代的Beaudette标准适应株相似，而显著高于其他几种本地分离的流行毒株（如GI-19型的210197GXNN）。Western Blot和RT-qPCR实验进一步证实，病毒在感染细胞后能有效复制并表达蛋白。重要的是，即使将250607GXCX在鸡胚中连续传代三次，其直接感染细胞的能力依然存在，表明这种细胞适应性并非由短暂的鸡胚传代诱导产生。不过，定量PCR比较显示，Beaudette株在DF-1细胞中的复制效率仍高于250607GXCX。

IBV 250607GXCX在SPF鸡中的致病性

为了评估该毒株对鸡的致病性，研究人员分别用250607GXCX感染了1日龄和14日龄的SPF鸡。结果显示，感染鸡只出现了咳嗽、流涕等呼吸道症状，但无死亡病例，体重增长也未受影响。剖检发现，病变主要集中于气管和肺部，表现为气管内黏液增多、出血点，以及肺脏充血、水肿。组织病理学观察可见气管黏膜结构破坏、纤毛脱落，肺泡结构破坏并有淋巴细胞浸润。病毒排放检测发现，感染后第3至15天是排毒高峰期，之后显著减少。器官病毒载量检测表明，病毒主要在呼吸道和淋巴器官（法氏囊、盲肠扁桃体）中复制，至感染后21天，肺中病毒载量仍相对较高。血清学检测证实，感染鸡只产生了针对IBV的特异性抗体，14日龄鸡的抗体阳转速度快于1日龄鸡。总体而言，250607GXCX对SPF鸡表现为一种主要侵害呼吸道、致病性较低的毒株。

IBV 250607GXCX致病性和细胞感染性差异的分析

为何250607GXCX能直接感染细胞而其致病性又相对较低？研究人员从分子层面进行了深入探索。氨基酸序列比对发现，250607GXCX的S1蛋白序列与其他毒株（包括Beaudette）的相似性低于70%，其S1蛋白中的高变区（HVR）序列差异尤其显著。利用AlphaFold3预测S1蛋白的三维结构并分析其与潜在宿主受体——α-2,3-唾液酸转移酶的相互作用时，发现了一个有趣的现象：细胞适应性强的250607GXCX和Beaudette毒株，其S1蛋白与α-2,3-唾液酸转移酶的预测结合亲和力反而弱于细胞适应性差的其他毒株（如210197GXNN等），且结合位点也较少。此外，250607GXCX与Beaudette的S1蛋白三维结构相似度较低（RMSD值高达17.731）。这些结果提示，α-2,3-唾液酸转移酶可能并非IBV入侵细胞的唯一或主要受体，250607GXCX和Beaudette可能利用了不同的受体或辅助因子进入细胞，其S1蛋白构象的差异可能影响了其受体结合特性与组织嗜性。

综合以上研究结果，可以得出主要结论：本研究成功分离并鉴定了一株属于GVII-1基因型的IBV毒株250607GXCX。该毒株具有两个突出特性：其一，它无需经过鸡胚适应传代即可高效感染Vero和DF-1细胞系，其细胞感染能力与经典的Beaudette适应株相似，为研究γ-冠状病毒的细胞入侵机制提供了一个宝贵的野生型病毒模型；其二，它对SPF鸡的致病性较低，主要引起呼吸道病变，不导致死亡。遗传进化分析表明该毒株可能由I0636/16毒株演化而来，并在其非S基因区（1b, 3a, M, N）与当地流行的GI-19和GI-7谱系毒株发生了重组。尤为重要的是，对病毒S1蛋白与潜在受体的相互作用分析表明，α-2,3-唾液酸转移酶可能不是介导250607GXCX和Beaudette细胞感染的关键受体，暗示IBV入侵细胞可能存在更复杂的、多样化的受体利用机制。

这项研究的意义在于，它不仅报道了一株具有独特细胞适应性的新型IBV毒株，拓宽了对IBV基因多样性的认识，而且其直接感染细胞的能力为在细胞水平上深入研究IBV的受体鉴定、入侵机制、抗病毒药物筛选和疫苗研发（尤其是作为反向遗传学疫苗载体）提供了新的强大工具。同时，研究结果也提醒养殖业需要加强对GVII等新谱系IBV的监测，警惕病毒通过基因突变和重组演变出新的生物学特性。未来研究的重点将聚焦于精确鉴定介导250607GXCX细胞入侵的宿主受体，并深入解析其S蛋白关键域的功能，以期最终阐明IBV跨种感染及细胞嗜性的分子基础。