通过工程改造异源核心启动子来优化毕赤酵母（Pichia pastoris）中的SES表达系统

《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》：Engineering heterologous core promoters to optimize the SES expression system for Pichia pastoris

合成生物学优化毕赤酵母表达系统，通过筛选Trichoderma reesei高表达基因的异源核心启动子，构建41种增强型SES系统，其中SES-CP32使mCherry表达量提升5.4倍。采用CRISPR/Cas9多拷贝整合策略，将Pro K酶活性提高4.6倍，验证了异源调控元件和多拷贝策略对提高表达效率的有效性。

　　合成生物学技术近年来在微生物生产领域取得了显著进展，特别是在拓展底物范围、产物种类以及宿主生物多样性方面。作为一种重要的工业酶生产系统和生物制药工具，Pichia pastoris（毕赤酵母）因其高效的分泌和表达能力、强大的调控性能以及低成本的培养方式而被广泛应用。然而，该系统在生产能力和转录调控方面仍存在一定的局限性，这限制了其在更广泛领域的应用。为了克服这些挑战，研究人员致力于优化P. pastoris的合成表达系统（SES），通过引入异源核心启动子来提升其表达效率。

在本研究中，研究团队从Trichoderma reesei（里氏木霉）中筛选出高表达基因的启动子，并将其整合到SES系统中，以增强其在P. pastoris中的功能表现。通过RNA-seq分析，研究人员获取了T. reesei QM9414菌株在不同碳源（纤维素、海藻糖和葡萄糖）条件下的转录组数据，进一步筛选出具有高表达潜力的基因启动子。这些启动子的序列被合成并构建为独立的表达载体，随后用于SES系统的优化。通过荧光强度检测，研究人员发现其中41个SES系统在表达mCherry蛋白方面优于传统的SES-A系统，最高提升了5.4倍。这表明，通过引入T. reesei的异源启动子，能够显著提高SES系统的表达效率。

此外，研究团队还采用了一种多拷贝策略，结合CRISPR/Cas9技术实现多靶点的快速整合，进一步优化了SES系统在P. pastoris中表达Pro K（蛋白酶K）的能力。结果显示，携带3个Pro K拷贝的菌株在发酵液中的酶活性比携带1个拷贝的菌株提高了4.6倍。这一成果不仅验证了多拷贝策略在提升蛋白表达效率方面的有效性，也为进一步改进SES系统的性能提供了新的思路。

P. pastoris的蛋白表达系统主要依赖于不同类型的启动子，包括可诱导和组成型启动子。可诱导启动子如P_AOX1在甲醇存在时能够高效驱动蛋白表达，但甲醇培养条件对工业应用提出了较高的控制要求和成本负担。相比之下，组成型启动子如P_GAP和P_TEF1能够在多种碳源下持续驱动蛋白表达，适用于不需要外源诱导的高产量表达系统。然而，尽管这些启动子在P. pastoris中表现出良好的性能，其表达效率仍受多种因素影响，如环境条件、发育阶段和代谢状态的变化，这可能导致基因表达水平的不稳定。因此，开发跨物种的启动子以实现稳定和可控的表达成为研究的重要方向。

本研究的创新点在于，通过系统筛选和优化T. reesei的高表达启动子，构建了一个更加高效和灵活的SES系统。该系统不仅适用于P. pastoris，还能够在多种丝状真菌中发挥作用，如T. reesei和Aspergillus niger。这种跨物种的适用性使得SES系统具有更高的通用性和扩展性，能够满足不同生物工程应用的需求。研究团队还发现，某些核心启动子区域的序列特征，如高A/C比和特定的保守序列，可能对启动子的功能具有重要影响。这些特征在P. pastoris中表现出对G碱基的非偏好性，进一步支持了异源启动子在优化表达系统中的潜力。

在实际应用中，研究人员成功利用优化后的SES系统表达了碱性蛋白酶Pro K，并通过多拷贝策略进一步提高了其表达效率。通过在发酵过程中对Pro K活性的检测，发现SES-CP32系统在表达Pro K方面优于传统的SES-A系统。然而，尽管SES-CP32表现出色，其在表达mCherry蛋白时的效果并不如SES-A，这说明不同蛋白对启动子的需求可能存在差异。因此，在构建SES系统时，需要根据目标蛋白的特性进行个性化优化，以实现最佳的表达效果。

多拷贝策略的实施不仅提高了Pro K的表达水平，还对菌株的生长特性产生了一定影响。随着Pro K拷贝数的增加，菌株的生长速率逐渐下降，这可能是由于外源蛋白对细胞代谢产生了负担。然而，即使在生长速率下降的情况下，Pro K的酶活性仍然保持较高水平，表明该策略在提升蛋白表达效率方面具有显著优势。同时，研究人员还发现，增加sTF（合成转录因子）和Pro K拷贝数的组合能够进一步提高表达效率，这为未来在不同生物工程应用中优化SES系统提供了新的方向。

本研究的成果为P. pastoris的合成表达系统带来了新的突破，不仅提高了蛋白表达的效率和稳定性，还拓展了其在工业生产中的应用潜力。通过引入异源启动子，研究人员成功构建了一个更加灵活和高效的表达系统，能够在不同环境条件下实现稳定的蛋白表达。此外，多拷贝策略的应用为提升表达水平提供了有效的手段，同时也提醒在实际应用中需要考虑菌株的耐受性和代谢压力，以实现最佳的蛋白产量。

总的来说，本研究展示了合成生物学在优化微生物表达系统方面的巨大潜力。通过整合异源启动子和多拷贝策略，研究人员不仅提升了SES系统的性能，还为未来在生物制造、生物制药和合成生物学领域提供了新的工具和方法。这些成果有助于推动P. pastoris在更广泛的应用场景中发挥作用，同时为其他微生物系统的表达优化提供了参考。未来的研究可以进一步探索这些启动子的调控机制，以及如何在不同宿主生物中实现更高效的表达。此外，还可以结合其他基因工程策略，如CRISPRa和CRISPRi技术，以实现更精确的表达调控，从而提升生物工程的效率和灵活性。