靶向HMGB1-OTUD5-MTORC1通路：探索恩曲替尼心脏毒性的新机制与干预策略

《Autophagy》：Entrectinib binds to HMGB1 and activates cardiomyocyte autophagy by inhibiting OTUD5-MTORC1 signaling to induce cardiotoxicity

本文揭示了恩曲替尼（entrectinib）通过直接结合高迁移率族蛋白B1（HMGB1）并促进其核转位，进而抑制去泛素化酶OTUD5的转录，最终导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（MTORC1）信号通路抑制和心肌细胞自噬（autophagy）过度激活，从而引发心脏毒性的新机制。研究进一步证实，丹参酮IIA（tanshinone IIA）作为HMGB1抑制剂，能够有效逆转恩曲替尼诱导的心肌损伤，为临床防治其心脏毒性提供了潜在靶点和干预策略。

　　

恩曲替尼是一种用于治疗携带NTRK融合基因的实体瘤和ROS1阳性非小细胞肺癌的靶向药物。尽管其抗肿瘤效果显著，但在临床应用中观察到心脏不良事件，如充血性心力衰竭和QTc间期延长，限制了其广泛应用。本研究旨在深入探究恩曲替尼诱导心脏毒性的分子机制，并寻找有效的干预策略。

恩曲替尼在体内外模型中诱发心脏毒性

研究首先在细胞和小鼠模型中证实了恩曲替尼的心脏毒性。体外实验显示，恩曲替尼处理可导致人心肌细胞系CCC-HEH-2存活率显著下降，并诱导细胞凋亡。在动物实验中，给予C57BL/6J小鼠恩曲替尼灌胃6周后，通过超声心动图检测发现，小鼠的左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）明显降低，表明心脏收缩功能受损。组织病理学分析进一步揭示了心肌组织损伤、纤维化增加以及心肌细胞凋亡。血清中心肌酶谱如肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）水平升高，也印证了心肌损伤的存在。

自噬激活是恩曲替尼心脏毒性的关键环节

为了探索毒性机制，研究人员进行了蛋白质组学分析。结果显示，恩曲替尼处理后，心肌细胞中与自噬相关的蛋白表达发生显著变化。通过GFP-mCherry-LC3荧光探针检测自噬流，发现恩曲替尼强烈诱导了心肌细胞自噬的激活。使用自噬抑制剂氯喹（CQ）或通过小干扰RNA（siRNA）敲低自噬关键基因ATG5或ATG7，均能有效抑制恩曲替尼诱导的心肌细胞凋亡，并改善细胞存活率。在动物模型中，氯喹的联合给药也部分逆转了恩曲替尼引起的心脏功能恶化和心肌损伤。这些结果明确了自噬过度激活在恩曲替尼心脏毒性中的核心作用。

恩曲替尼通过抑制MTORC1信号通路激活自噬

机制上，磷酸化蛋白质组学分析提示，恩曲替尼可能通过影响MTORC1信号通路来调控自噬。Western blot实验证实，恩曲替尼处理显著降低了心肌细胞中MTORC1下游效应蛋白核糖体蛋白S6（RPS6）的磷酸化水平（p-RPS6），表明MTORC1信号通路被抑制。ULK1是MTORC1调控自噬起始的关键下游分子。研究发现，敲低ULK1可逆转恩曲替尼诱导的自噬和凋亡。相反，使用MTORC1激动剂MHY1485或敲低MTORC1的负调控因子AKT1S1/PRAS40以增强MTORC1活性，均能有效拮抗恩曲替尼的促凋亡作用。这证明恩曲替尼是通过抑制MTORC1信号来激活自噬的。

OTUD5是MTORC1信号通路的上游调控因子

蛋白质组学数据进一步将去泛素化酶OTUD5锁定为潜在的关键分子。恩曲替尼处理显著降低了OTUD5的蛋白和mRNA水平。功能实验表明，敲低OTUD5会抑制p-RPS6水平，激活自噬，并诱导心肌细胞凋亡，模拟了恩曲替尼的作用。而过表达OTUD5则能部分逆转恩曲替尼的毒性效应。这些结果确立了OTUD5作为MTORC1信号通路的正调控因子，其表达下调是恩曲替尼抑制MTORC1并激活自噬的重要环节。

恩曲替尼通过促进HMGB1核转位抑制OTUD5转录

那么，恩曲替尼是如何导致OTUD5表达下降的呢？研究发现，恩曲替尼并不影响OTUD5蛋白的稳定性，而是抑制了OTUD5基因的转录活性。蛋白质组学同时显示，恩曲替尼处理后，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的表达上调且核定位增加。HMGB1是一种核内非组蛋白染色质结合蛋白，可调节基因转录。实验证实，过表达HMGB1会抑制OTUD5启动子活性，降低其mRNA水平；而敲低HMGB1则产生相反效果。重要的是，当HMGB1的核定位序列（NLS）发生突变，使其无法进入细胞核时，其对OTUD5转录的抑制作用消失。这表明HMGB1对OTUD5的转录抑制依赖于其核定位。

恩曲替尼直接结合HMGB1并促进其核转位

分子对接模拟和微量热泳动（MST）实验均证实，恩曲替尼能够直接与HMGB1蛋白结合（K_d = 65.46 μM）。点突变实验进一步表明，HMGB1蛋白第103位的苯丙氨酸是其与恩曲替尼相互作用并介导核转位的关键位点。因此，恩曲替尼是作为HMGB1的配体，直接结合并促进其核转位，进而抑制OTUD5转录的。

抑制HMGB1可挽救恩曲替尼的心脏毒性

基于上述机制，研究评估了靶向HMGB1的治疗潜力。在细胞水平，利用siRNA敲低HMGB1或使用HMGB1抑制剂丹参酮IIA，均能有效抑制恩曲替尼诱导的自噬和凋亡。为了进行体内验证，研究人员构建了心肌细胞特异性Hmgb1基因敲除（Hmgb1^-/-）小鼠模型。结果显示，与野生型对照相比，Hmgb1^-/-小鼠对恩曲替尼的心脏毒性作用表现出明显的抵抗性，其心脏功能（EF、FS）、心肌结构、纤维化程度、细胞凋亡和线粒体超微结构均得到显著改善。同时，心肌组织中OTUD5表达和p-RPS6水平恢复，自噬标志物LC3-II积累减少。更重要的是，在野生型小鼠中，联合给予恩曲替尼和丹参酮IIA，能够有效预防恩曲替尼单独给药所导致的心脏功能不全、心肌损伤、纤维化、细胞凋亡和线粒体破坏。免疫组化分析证实，丹参酮IIA处理逆转了恩曲替尼引起的HMGB1核积累、OTUD5表达下调、p-RPS6减少以及LC3-II增加。此外，敲低OTUD5或使用MTORC1抑制剂雷帕霉素（rapamycin）可取消丹参酮IIA的保护作用，证明其疗效确实依赖于恢复OTUD5-MTORC1信号通路。

综上所述，本研究阐明了恩曲替尼诱导心脏毒性的一条新颖信号轴：恩曲替尼直接结合HMGB1，促进其核转位；核内HMGB1抑制OTUD5的转录，导致OTUD5表达下调；OTUD5的减少进而抑制MTORC1信号通路活性，最终引发心肌细胞自噬过度激活和凋亡，造成心脏损伤。研究首次揭示了HMGB1-OTUD5-MTORC1通路在药物性心脏毒性中的核心作用，并验证了HMGB1抑制剂丹参酮IIA作为潜在防治策略的有效性，为临床管理恩曲替尼相关心脏不良反应提供了重要的理论依据和转化医学前景。