基因组辅助克隆小麦叶锈病抗性基因Lr.ace-4A/Lr30及其功能表征

《Nature Communications》：Genome-assisted identification of wheat leaf rust resistance gene Lr.ace-4A/Lr30

本研究针对小麦叶锈病的严重威胁，通过构建高质量硬粒小麦参考基因组结合EMS诱变和转录组测序，成功克隆了位于染色体4A重组稀疏区的抗病基因Lr.ace-4A，并证实其与六倍体小麦中已知的Lr30基因为同一基因。该基因编码具有串联NB-ARC结构域的非典型NLR受体，在四倍体小麦中表现出近乎免疫的抗性，但在六倍体背景下效果减弱。研究还开发了特异性分子标记，为小麦抗病育种提供了重要资源。

　　

小麦作为全球最重要的粮食作物之一，为人类提供了约五分之一的卡路里和蛋白质摄入。然而，小麦生产长期受到真菌病害的威胁，其中由叶锈菌（Puccinia triticina, Pt）引起的小麦叶锈病尤为严重，在适宜条件下可造成重大产量损失。随着全球气候变化和病原菌毒性不断进化，叶锈病已成为威胁全球小麦生产的首要生物胁迫因素。

培育抗病品种是防治叶锈病最经济有效的策略。目前，小麦及其野生近缘种中已有80多个叶锈病抗性（Lr）基因被正式命名，但由于小麦基因组庞大复杂，仅有12个Lr基因被成功克隆。传统育种方法在利用这些抗性基因时面临诸多挑战，特别是当目标基因位于染色体重组稀疏区域时，基因定位和克隆工作更加困难。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员聚焦于葡萄牙硬粒小麦地方品种PI 192051，该材料对来自中国、美国、突尼斯、摩洛哥和埃塞俄比亚的多个Pt小种表现出强烈抗性。前期遗传分析发现其携带一个显性Lr基因，命名为Lr.ace-4A，定位在染色体4AS的着丝粒附近区域。而此前在六倍体小麦中发现的Lr30基因则被描述为隐性抗性基因，同样位于4AL染色体上，但在硬粒小麦中未见报道。

为了攻克这一科学难题，研究团队开展了系统性研究。他们首先利用PacBio HiFi和Hi-C测序技术，构建了硬粒小麦地方品种PI 192051的高质量染色体级别参考基因组，其大小为10.51Gb，contig N50达到42.53Mb，显著优于已发表的其他四倍体小麦基因组。这一基因组资源为后续基因克隆工作奠定了坚实基础。

通过对PI 192051进行EMS诱变，研究人员从1853个独立M2突变体家系中筛选出7个叶锈病感病突变体。利用基因组辅助克隆策略，他们将候选区域缩小到染色体4A上一个396.85Mb的区间，包含1137个高置信度基因。通过RNA-seq分析7个感病突变体的转录组数据，发现只有一个NLR基因（PI192051.r1.4AG0210600）在所有突变体中均存在EMS诱导的点突变。

该基因包含3个外显子和2个内含子，编码一个1174个氨基酸的非典型NLR蛋白，具有串联核苷酸结合（NB-ARC）结构域。研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术验证了该基因的必要性：敲除该基因的转基因植株完全丧失了对Pt的抗性。同时，转基因互补实验证明，将包含该基因完整编码区及其调控序列的9.3kb基因组片段转入感病突变体后，能够恢复抗性，证实了该基因的充分性。

进一步研究发现，Lr.ace-4A与六倍体小麦中的Lr30基因序列完全一致，位于相同的基因组区域，且对Pt小种的抗性反应特征相似，表明二者为同一基因。然而，该基因在四倍体和六倍体小麦背景下的抗性表现存在明显差异：在PI 192051中表现为近乎免疫（感染型IT=0），而在六倍体小麦中仅显示中等抗性（IT=1-2+）。转基因实验证实，Lr.ace-4A在六倍体小麦背景下的抗性确实减弱，但通过过表达该基因可以增强抗性水平。

单倍型分析发现，两个关键氨基酸多态性（E533K和R662C）区分了抗感和感病单倍型。转基因功能验证表明，任一氨基酸替换都会导致基因完全丧失抗性功能。基于这两个关键多态性，研究人员开发了特异性分子标记Lr30MAS-47FR，为分子标记辅助选择育种提供了实用工具。

功能表征显示，Lr.ace-4A在Pt侵染后表达上调，其编码蛋白定位于细胞质和细胞核。AlphaFold2多聚体模式预测表明，该蛋白能够形成五聚体抵抗体结构，两个关键氨基酸位点分别位于抵抗体结构的结合界面和外部表面。

本研究成功克隆了小麦叶锈病抗性基因Lr.ace-4A/Lr30，解决了长期以来关于该基因身份的争议。研究不仅提供了高质量的硬粒小麦基因组资源，还阐明了该基因在不同倍性小麦背景下的抗性表现差异及其分子机制。发现的關鍵氨基酸位点为通过基因编辑技术改良小麦抗病性提供了潜在靶点。此外，开发的分子标记将加速该基因在小麦育种中的应用，为培育持久抗病品种提供了重要基因资源和理论依据。

该研究的创新性在于将基因组学、遗传学和功能基因组学技术有机结合，克服了染色体重组稀疏区域基因克隆的技术瓶颈，为类似难克隆基因的研究提供了可借鉴的技术路线。研究成果对保障小麦安全生产、减少化学农药使用具有重要实践意义，也为理解NLR蛋白的进化与功能多样性提供了新见解。