阿托伐他汀靶向METTL3/IGF2BP1/CXCL2通路缓解脓毒症心肌病的机制研究

《Journal of Inflammation Research》：Atorvastatin Alleviates Sepsis-Induced Cardiomyopathy by Targeting the METTL3/IGF2BP1/CXCL2 Pathway

本研究揭示了阿托伐他汀（ATO）通过直接靶向结合并抑制m6A甲基转移酶METTL3，进而下调整体m6A修饰水平，并通过METTL3/IGF2BP1轴降低CXCL2 mRNA的稳定性，最终抑制脓毒症诱导的心肌细胞炎症反应和铁死亡，为脓毒症心肌病（SICM）的临床防治提供了新的分子靶点和理论依据。

　　

Abstract

背景

脓毒症心肌病（Sepsis-induced cardiomyopathy, SICM）是脓毒症和脓毒性休克患者常见且严重的并发症。其病理生理机制高度复杂，常导致多器官系统功能障碍，而目前的临床干预策略疗效有限。他汀类药物已被证明可以降低脓毒症患者的死亡率，并减轻脓毒症引起的多器官损伤，包括SICM。然而，阿托伐他汀（Atorvastatin, ATO）发挥心脏保护作用的分子机制尚未完全阐明。本研究旨在通过体内和体外实验系统探索ATO对SICM的心脏保护作用，并阐明其心脏保护作用的分子机制。

方法

通过盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture, CLP）手术使小鼠暴露于多细菌性脓毒症环境，并在术前连续6天用ATO预处理。通过超声心动图评估心功能。采用免疫组织化学和蛋白质印迹法（Western blotting）研究ATO对脓毒症小鼠心脏损伤的保护作用。使用AutoDock软件、细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性（Drug Affinity Responsive Target Stability, DARTS）实验验证ATO与METTL3的特异性结合。此外，通过m⁶A甲基化RNA免疫共沉淀测序（m⁶A-MeRIP-seq）、RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）和Western blotting阐明了METTL3介导的m⁶A修饰在脓毒症心肌炎症损伤中的调控作用及其分子机制。

结果

ATO能明显改善脓毒症小鼠的心功能，减轻心脏组织损伤，并抑制炎症因子和心肌损伤因子的释放。机制上，ATO以高亲和力与METTL3结合并抑制其表达，从而抑制脓毒症小鼠心脏组织和脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激的心肌细胞中整体m⁶A修饰水平。重要的是，METTL3通过介导CXCL2 mRNA的m⁶A修饰，并以IGF2BP1依赖的方式增强CXCL2 mRNA的稳定性，从而促进CXCL2的表达。CXCL2的高表达最终触发心肌细胞的炎症反应和铁死亡，导致脓毒症心肌损伤。

结论

本研究阐明了METTL3 (m⁶A)/IGF2BP1/CXCL2轴促进了SICM的病理进展，而ATO通过靶向该通路发挥心脏保护作用，为RNA m⁶A修饰在SICM中的意义提供了新的见解。

Introduction

脓毒症是一种快速进展、危及生命的疾病，其特征是由于宿主对感染的反应失调而导致多器官功能障碍。脓毒症心肌功能障碍，也称为SICM，是脓毒症患者常见且严重的并发症。在中国，ICU患者中脓毒症的发生率为20.6%，其90天死亡率高达35.5%，造成了巨大的经济和社会负担。其中，约40%的患者经历心肌损伤，相关死亡率高达70-90%。SICM的发展是一个复杂的过程，由钙稳态破坏、炎症、细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能障碍等引起。目前SICM的治疗策略与脓毒症的常规治疗相似，主要是使用支持性疗法控制感染源，包括液体复苏、氧疗和改善心功能的血管活性药物（如去甲肾上腺素和多巴酚丁胺）。然而，这些疗法在提高SICM患者生存率方面效果有限。因此，迫切需要开发针对SICM病理机制的新型靶向治疗策略。

他汀类药物不仅具有降脂作用，还能通过调节炎症反应、免疫稳态和凝血途径发挥多种药理作用。研究表明，他汀类药物可以保护内皮功能，减轻脓毒症相关的炎症损伤，并显著抑制TLR4、IL-6、TNF-α和IL-1β等关键炎症因子的释放。流行病学证据进一步证实，他汀类药物治疗可以降低脓毒症相关疾病患者的发病率和死亡率，并减轻脓毒症的并发症，如心肌损伤、肺损伤、认知功能障碍等。然而，值得注意的是，虽然他汀类药物在SICM中发挥心脏保护作用，但其具体的分子调控机制尚未完全阐明。因此，深入分析SICM的发病机制和他汀类药物的靶点，将为开发靶向临床防治策略奠定关键的理论基础。

N⁶-甲基腺苷（m⁶A）作为真核生物RNA中最常见的转录后修饰，通过动态调节RNA剪接、加工、翻译、降解和mRNA稳定性等核心代谢过程，广泛影响基因表达。这种修饰的动态性由三类功能蛋白精确协调：甲基转移酶复合物（以METTL3为催化核心，METTL14/WTAP为结构辅助因子）作为“书写器”催化甲基化；去甲基化酶（如FTO、ALKBH5）作为“擦除器”去除修饰；阅读蛋白（包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、IGF2BP1/2/3等）作为“阅读器”识别修饰信号。该调控网络的失衡已被证明驱动癌症、神经系统发育、免疫紊乱和心血管疾病等多种病理过程。作为一种关键的RNA修饰，m6A调节基因表达，并可能影响心脏组织的炎症和细胞存活。核心催化亚基METTL3在自身免疫性疾病、炎症性疾病和脓毒症中的作用受到广泛关注。例如，METTL3通过抑制RIG-I-MAVS先天免疫通路促进非小细胞肺癌进展。在脓毒症诱导的心肌损伤中，METTL3/YTHDF1介导的m⁶A修饰稳定了USP12 mRNA，从而促进FOXO3去泛素化，加剧脓毒症诱导的心肌功能障碍中的心肌细胞凋亡。此外，METTL3通过抑制核因子κB（NF-κB）通路减轻脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症。重要的是，METTL3的炎症调节功能与SICM的病理机制密切相关。当脓毒症发生时，大量促炎细胞因子被释放，可直接损伤心肌细胞，抑制心肌收缩功能，导致心肌功能障碍。因此，深入分析m⁶A修饰（尤其是METTL3介导的调控轴）在脓毒症和SICM中的作用机制，将为寻找以m⁶A修饰为切入点的抗心肌炎症信号抑制剂提供关键理论依据，并进一步推动临床防治策略的创新。

白细胞介素17（IL-17）作为免疫炎症的核心介质，驱动感染和自身免疫性疾病中的炎症病理过程。荟萃分析显示，非存活脓毒症患者的IL-17浓度是存活者的5.96倍，证实了其作为脓毒症死亡风险独立预测因子的潜力。过量的IL-17A可破坏免疫稳态，可能导致包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和心功能障碍在内的器官功能障碍，表明它可能在脓毒症及其诱导的多器官功能障碍中起关键作用。此外，研究表明IL-17可激活特异性转录因子NF-κB并促进其核转位，特异性结合CXCL2基因启动子以增强其转录，最终导致CXCL2蛋白表达显著增加。脓毒症中上调的CXCL2进一步介导中性粒细胞向炎症部位浸润，放大组织损伤。

由于ATO可能调节炎症，且IL-17–CXCL2信号驱动炎症损伤，理解这一联系可能揭示ATO心脏保护机制的一部分。虽然他汀类药物在脓毒症中显示出益处，但阿托伐他汀在SICM中保护心脏的确切分子机制仍不清楚，特别是在RNA甲基化通路方面。本研究旨在阐明METTL3介导的m⁶A修饰在SICM心肌炎症损伤中的调控机制，并揭示ATO作为METTL3抑制剂，通过靶向抑制METTL3/CXCL2轴来减轻心肌损伤的作用机制。这些结果将为ATO在SICM防治中的临床应用提供创新的分子靶点和理论依据。

Results

ATO改善脓毒症小鼠心功能障碍

研究表明他汀类药物可显著改善脓毒症小鼠的心功能障碍。因此，采用CLP建立小鼠脓毒症模型，以进一步探讨ATO对脓毒症小鼠心脏损伤的保护作用。为了评估ATO对脓毒症小鼠心功能的影响，使用超声心动图检测各组小鼠的心功能指标。结果显示，与假手术组相比，CLP组小鼠心功能明显受损，表现为射血分数（EF%）、短轴缩短率（FS%）、左心室收缩期末期内径（LVAWs）、左心室收缩期后壁厚度（LVPWs）、左心室舒张期后壁厚度（LVPWd）的下降以及左心室舒张期末期内径（LVAWd）的增加。用ATO（20或40 mg/kg）预处理可显著改善脓毒症小鼠受损的心功能。此外，各组小鼠的心率（HR）和心脏重量/体重比（HW/BW）无显著差异。在组织学分析方面，H&E染色显示CLP组小鼠心肌纤维排列紊乱，炎症细胞浸润增加，而ATO预处理能有效缓解这些病理变化。而且，与CLP组相比，ATO预处理显著降低了肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的表达水平。以上结果表明ATO预处理能有效改善脓毒症小鼠的心功能障碍。其中，当ATO浓度为20 mg/kg时效果最为显著。

ATO抑制脓毒症小鼠炎症因子释放以及心脏组织中m⁶A修饰水平和METTL3的表达

由于炎症反应在脓毒症和SICM中起关键作用，我们进一步检测了各组小鼠血清中炎症因子的释放水平，发现与假手术组相比，脓毒症组TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平升高。ATO预处理，特别是20和40 mg/kg剂量，能显著抑制脓毒症小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β的高表达。为了进一步研究ATO对炎症信号通路的调节，采用免疫组织化学法检测心脏组织中TLR4的表达，发现ATO预处理显著降低了脓毒症诱导的TLR4上调。此外，Western blotting分析显示，脓毒症小鼠心脏组织中COX2和IL-6的蛋白表达显著增加，ATO预处理能有效抑制这两种蛋白的表达，提示ATO可能通过调节炎症信号通路发挥心脏保护作用。

作为真核mRNA中最常见的转录后修饰，m⁶A已被证明参与脓毒症的诊断、治疗和预后。先前研究表明，m⁶A及其相关调节因子可通过调节炎症反应、细胞凋亡、细胞焦亡等途径影响SICM的发生发展。鉴于此，我们首先检测了心脏组织中m⁶A修饰水平的变化。ELISA结果显示，脓毒症组小鼠心脏中m⁶A修饰水平显著增加，而ATO预处理能有效降低这种修饰水平的增加。鉴于METTL3是m⁶A甲基转移酶复合体的核心成分，我们通过Western blotting进一步检测了其蛋白表达水平，发现METTL3的表达在脓毒症组明显上调，而ATO预处理能显著抑制脓毒症诱导的METTL3高表达。以上结果表明，ATO预处理可通过抑制炎症因子的释放，减轻脓毒症小鼠的心肌炎症浸润和损伤。值得注意的是，我们的结果提示METTL3介导的m⁶A修饰可能参与了ATO对抗脓毒症心肌炎症损伤的保护过程。

ATO减轻LPS诱导的心肌细胞炎症损伤

脓毒症是由感染引发的过度炎症反应，其病理进展主要由炎症级联反应驱动。为了研究ATO对SICM的保护机制，我们通过用LPS刺激HL-1心肌细胞构建了体外脓毒症诱导的心肌损伤模型。结果显示，LPS处理以剂量依赖性方式抑制HL-1心肌细胞的细胞活力，伴随LDH释放增加，并显著上调炎症蛋白COX2和IL-6的表达水平。然而，LPS诱导的细胞损伤可被ATO预处理所缓解，表现为细胞活力增加、LDH释放减少以及促炎因子IL-1β水平降低。此外，Western blotting分析进一步证明ATO预处理能显著抑制LPS诱导的COX2和IL-6蛋白高表达水平。因此，这些发现得出结论，ATO预处理可通过抑制炎症因子的表达来减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。

ATO直接与METTL3相互作用

为了进一步探索ATO是否通过调节m⁶A修饰发挥心脏保护作用，我们检测了HL-1心肌细胞中m⁶A修饰水平和METTL3的表达。结果显示，LPS刺激可显著增加心肌细胞中的m⁶A修饰水平，并显著上调METTL3的表达，而ATO预处理抑制了LPS诱导的m⁶A修饰水平增加和METTL3表达。这些体外实验结果与动物模型中的发现高度一致，进一步证实ATO可能通过调节METTL3介导的m⁶A修饰发挥心脏保护作用。为了阐明ATO调节METTL3表达的具体机制，我们使用Autodock软件进行了分子对接模拟。结果表明ATO与METTL3蛋白具有相对较高的结合亲和力。进一步的DARTS和CETSA实验证实，ATO可与METTL3结合形成稳定复合物，表现为抗蛋白酶降解能力增强和热稳定性提高。以上结果表明ATO可能通过直接靶向METTL3并抑制m⁶A修饰来减轻脓毒症相关的心肌损伤。

ATO通过调节METTL3/m⁶A信号通路抑制LPS诱导的心肌细胞炎症损伤

为了阐明METTL3在ATO介导的心脏保护作用中的角色和机制，我们使用siRNA敲低了METTL3的表达。结果发现，敲低METTL3可显著抑制LPS处理的HL-1心肌细胞中心肌损伤标志物（CK-MB和LDH）、炎症因子（TNF-α和IL-1β）以及炎症相关蛋白COX2的表达水平升高。为了进一步验证ATO的心脏保护作用是否依赖于对METTL3的调节，我们在LPS刺激并用ATO预处理的HL-1心肌细胞中过表达或敲低METTL3。结果显示，在LPS+ATO共同处理条件下，METTL3过表达可逆转ATO的保护作用，导致心肌损伤标志物和炎症因子水平进一步升高。相反，敲低METTL3可进一步增强ATO对上述指标表达的抑制作用。以上结果证明ATO可通过调节METTL3介导的m⁶A修饰来减轻LPS诱导的心肌细胞炎症损伤。

METTL3通过m⁶A-IGF2BP1依赖机制增强CXCL2 mRNA稳定性以促进脓毒症心肌细胞炎症损伤

为了进一步揭示METTL3调节SICM的分子机制，我们在敲低HL-1心肌细胞中METTL3后进行了m⁶A-MeRIP-seq分析。结果显示，敲低METTL3导致全基因组m⁶A修饰水平发生显著改变。GO分析显示，m⁶A修饰下调的基因显著富集于以下生物过程：磷代谢过程、大分子生物合成调节等。细胞组分如细胞质和溶酶体受差异表达基因影响显著。主要分子功能包括蛋白结合和催化活性。进一步分析发现，差异表达的m⁶A修饰基因主要富集于与炎症和免疫调节相关的信号通路，如TNF信号通路、MAPK信号通路和IL-17信号通路。其中，已证实IL-17信号通路与脓毒症的严重程度相关。而IL-17信号通路中的关键蛋白CXC趋化因子配体2（CXCL2）在脓毒症患者中表达增加，提示CXCL2可能在脓毒症的病理进展中起关键调控作用。因此，我们重点关注关键效应分子CXCL2，其在mRNA上的m⁶A修饰水平在METTL3敲低后显著降低。Western blotting分析进一步证实，敲低METTL3下调了IL-17和CXCL2的蛋白表达，而过表达则呈现相反效果。

使用基于序列的m⁶A修饰位点预测工具（SRAMP），我们在CXCL2基因组上鉴定出多个潜在的m⁶A修饰位点。随后，RIP-qRT-PCR进一步证实了CXCL2 mRNA上存在m⁶A修饰，且该修饰水平在METTL3敲低后显著降低。为了进一步探索下游调控机制，我们检测了LPS处理的HL-1心肌细胞中m⁶A“阅读器”的表达谱，发现LPS刺激后IGF2BP1的表达显著上调。敲低IGF2BP1降低了CXCL2的mRNA和蛋白表达。进一步的RNA稳定性分析显示，敲低METTL3或IGF2BP1加速了CXCL2 mRNA的降解。总之，这些发现揭示了一种分子机制：METTL3介导的m⁶A修饰通过IGF2BP1依赖途径增强CXCL2 mRNA稳定性并促进其表达。该调控轴在LPS诱导的心肌细胞损伤中起重要作用。

METTL3通过CXCL2介导的炎症反应和铁死亡加剧脓毒症诱导的心肌损伤

接下来，我们通过一系列功能回复实验阐明了CXCL2作为METTL3下游效应分子在心肌细胞炎症损伤中的关键作用。CXCL2作为一种重要的促炎趋化因子，可通过招募中性粒细胞等免疫细胞加剧炎症反应。我们同时在HL-1心肌细胞中转染OV-METTL3和CXCL2 siRNA，并检测心肌损伤因子（CK-MB和LDH）和炎症因子（TNF-α和IL-1β）的表达水平。结果显示，OV-METTL3显著促进了LPS诱导的心肌损伤标志物（CK-MB、LDH）和炎症因子（TNF-α、IL-1β）的表达，而CXCL2沉默有效逆转了这种效应。有报道称CXCL2过表达可诱导铁死亡。因此，我们还检测了心肌细胞中Fe²⁺、脂质过氧化产物MDA和抗氧化剂GSH的水平，结果表明OV-METTL3促进了LPS诱导的Fe²⁺积累和脂质过氧化产物MDA的生成，同时降低了抗氧化GSH水平。这些变化均被CXCL2沉默所逆转。类似地，CXCL2沉默上调了铁死亡抑制蛋白SLC7A11和GPX4的表达，而METTL3过表达逆转了这种保护作用。这些结果揭示了METTL3通过CXCL2调节LPS诱导的心肌细胞炎症损伤的新机制，为理解脓毒症诱导心肌损伤的分子机制提供了新的理论视角。

Discussion

他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，不仅具有降脂作用，还表现出多种胆固醇非依赖性效应，包括抗氧化、免疫调节和抗炎活性。近年来，它们已成为传染病宿主导向治疗的研究热点。例如，瑞舒伐他汀可通过抑制NF-κB活化，减少LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中促炎细胞因子的释放。在脓毒症模型中，ATO显示出积极的治疗潜力，表现为改善平均动脉压和减轻微血管炎症。其抗炎作用与促炎性一氧化氮合酶II的下调密切相关。此外，ATO还能通过激活细胞外调节蛋白激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶通路诱导血红素加氧酶-1，从而减弱LPS诱导的TNF-α表达。这些发现共同证实了他汀类药物广泛的非胆固醇依赖性抗炎作用及其在脓毒症治疗中的价值。然而，这些先前的研究主要将他汀类药物的保护作用归因于典型的NF-κB或MAPK介导的抗炎级联反应，而对上游的表观遗传或转录组决定因素探索甚少。相比之下，本研究进一步证实ATO能有效缓解脓毒症诱导的心肌功能障碍，表现为改善心功能、减轻心肌组织病理损伤以及抑制炎症细胞因子的释放。重要的是，我们发现ATO对SICM的保护作用是通过抑制METTL3 (m⁶A)/IGF2BP1/CXCL2信号通路实现的。这一发现不仅为ATO治疗脓毒症相关心脏损伤提供了更深的理论基础，也为探索新的治疗策略提供了方向。

本研究聚焦于RNA m⁶A修饰的作用。作为RNA上最常见的修饰之一，m⁶A修饰在各种生理和病理过程中至关重要，其水平在脓毒症患者和动物模型中升高。本研究观察到脓毒症小鼠心脏组织中m⁶A修饰水平显著增加，而ATO治疗可降低m⁶A修饰水平。在体外，结果也显示ATO预处理可降低LPS诱导的HL-1心肌细胞中高m⁶A修饰水平。为了阐明ATO调节m⁶A修饰水平的靶点，我们进行了分子对接（AutoDock软件）、CETSA、DARTS实验和Western blotting分析，发现ATO能以高亲和力与METTL3结合并抑制其表达。这种对METTL3的抑制最终减轻了心肌细胞炎症损伤，表现为炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和心肌损伤标志物（CK-MB和LDH）的显著下调。总之，本研究揭示了METTL3介导的m⁶A修饰是ATO缓解SICM的重要机制。

为了进一步揭示METTL3在调节心肌炎症损伤中的分子机制，我们敲低了心肌细胞中METTL3的表达并进行了m⁶A-MeRIP-seq分析。结果显示，m⁶A修饰水平显著下调的基因主要富集于与炎症和免疫密切相关的信号通路，如TNF、MAPK和IL-17。其中，IL-17信号通路在脓毒症相关器官损伤的发生发展中起关键作用。该通路的激活触发大量中性粒细胞浸润组织和器官，在炎症部位释放活性氧和蛋白酶，导致组织细胞炎症损伤和死亡，从而引发或加剧器官功能障碍。为了进一步研究METTL3的下游影响，我们重点关注了IL-17信号通路，已知该通路在脓毒症相关器官损伤中发挥作用。值得注意的是，CXCL2是IL-17信号通路下游的关键效应分子。研究发现IL-17可促进CXCL2等趋化因子的表达，从而招募中性粒细胞至心脏组织，加剧心肌炎症和损伤。在脓毒症中，已证实CXCL2表达增加，且其水平与心肌损伤标志物呈正相关。本研究的主要发现是METTL3/IGF2BP1通过介导m⁶A修饰增强CXCL2 mRNA的稳定性和表达水平，从而加剧SICM。

研究揭示，CXCL2不仅是一种促炎趋化因子，还可能作为炎症与铁死亡之间的桥梁。CXCL2通过结合趋化因子受体CXCR2，诱导中性粒细胞和单核细胞等炎症细胞向炎症或感染区域迁移，刺激它们释放大量炎症细胞因子并放大炎症级联反应。炎症反应常伴随显著的氧化应激，这是诱导铁死亡的重要因素。有报道称CXCL2过表达可通过加剧氧化应激或干扰细胞内铁代谢，使细胞更容易发生铁死亡。在我们的研究中，我们发现敲低CXCL2能有效逆转METTL3过表达对铁死亡相关指标的影响，表现为细胞内Fe²⁺和脂质过氧化产物MDA水平降低，抗氧化GSH水平升高，以及关键铁死亡抑制蛋白SLC7A11和GPX4表达上调。总之，METTL3增强CXCL2的表达和稳定性，不仅触发心肌细胞的炎症反应，还促进铁死亡过程，共同加剧SICM。这一发现为更深入理解SICM的发病机制和探索新的治疗靶点奠定了重要基础。

本研究存在几个局限性，需要在未来的工作中充分考虑。首先，研究设计采用了预防性给药策略而非治疗性干预，这可能限制了对心肌损伤自然进程及其与治疗动态关系的直接评估。其次，由于缺乏治疗SICM的阳性对照药物，难以准确比较不同治疗策略的疗效差异。第三，未系统评估ATO在SICM干预背景下的潜在毒副作用，特别是在长期或高剂量应用时。第四，对铁死亡机制的分析不够全面，需要进一步分析在ATO干预下脂质过氧化过程（起始、传播和终止）的复杂调控网络。最后，本研究24小时的观察期侧重于急性期反应，未能评估长期生存率和器官功能恢复情况。未来需要延长监测周期以研究潜在的延迟效应。

Conclusion

总之，我们证明ATO通过靶向并抑制METTL3介导的m⁶A修饰，显著缓解SICM。核心机制是ATO以高亲和力与METTL3结合并抑制其表达，显著降低心脏组织中的m⁶A修饰水平，从而阻断METTL3介导的CXCL2 mRNA的m⁶A修饰，并以IGF2BP1依赖性方式抑制CXCL2 mRNA的稳定性，最终抑制CXCL2的表达。对该通路的抑制有效减轻了心肌细胞的炎症和铁死亡，从而改善心功能和组织结构损伤。该机制从表观遗传学角度阐明了SICM的关键致病通路，为临床干预提供了创新靶点。