通过自适应和可编程防御策略构建广谱抗噬菌体大肠杆菌工程菌

《Applied and Environmental Microbiology》：Engineering broad-spectrum phage-resistant Escherichia coli via adaptive and programmable defense strategies

本研究报告了一种新型烈性大肠杆菌噬菌体TR2的特性，并系统比较了自发突变和CRISPR/Cas9介导的免疫两种策略在构建抗噬菌体大肠杆菌菌株中的应用。研究发现，自发突变可提供广谱抗性但伴随适应性代价，而CRISPR/Cas9系统则能提供长期、可编程的免疫保护且生长缺陷最小。两种策略均能在不影响重组蛋白生产的前提下有效保护细菌培养物免受噬菌体感染，为工业发酵过程中噬菌体污染的防控提供了理论与实践指导。

　　

摘要

噬菌体污染是影响工业发酵产品质量和生产效率的主要挑战。尽管细菌进化出了多种防御系统来对抗噬菌体感染，但这些系统通常存在宿主特异性窄和效力有限的问题。本研究从受污染的发酵底物中分离并鉴定了一种新型烈性大肠杆菌噬菌体TR2。其强大的环境稳定性、短的潜伏期和高裂解活性使其对发酵过程构成重大威胁。基于该噬菌体的生理特性和基因组特征，研究人员开发了两种策略来生成抗噬菌体大肠杆菌菌株：（i）选择细菌表面受体的自发突变以防止噬菌体吸附和感染；（ii）整合外源CRISPR/Cas9系统以赋予序列特异性免疫。自发突变提供广谱抗性，但以适应性和进化稳定性为代价，而CRISPR/Cas9确保长期、可编程的免疫，且生长缺陷最小。重要的是，两种策略都成功地保护了细菌培养物免受噬菌体感染，且不影响重组蛋白的生产，凸显了它们在工业应用中的潜力。

引言

噬菌体污染，特别是在发酵过程中，对生物技术产业构成了重大挑战。噬菌体是特异性感染细菌的病毒，可通过降低产量和污染产品严重破坏工业规模的发酵。这不仅损害了最终产品的质量，还导致巨大的经济损失。当前解决工业发酵中噬菌体污染的策略主要依赖于使用化学处理或物理方法来去除或灭活噬菌体。然而，这些方法往往效率低下、成本高昂或对整体发酵过程造成干扰。因此，迫切需要开发更高效、可持续的策略来预防和控制生物技术应用中的噬菌体爆发。

为了对抗噬菌体入侵，细菌已经发展出广泛的防御系统，其中许多已被用于生物技术目的。这些系统包括限制修饰系统、CRISPR/Cas系统、流产感染系统、噬菌体排斥系统以及毒素-抗毒素系统。限制修饰系统充当细菌免疫系统，识别并切割入侵噬菌体的外源DNA。流产感染系统则通过牺牲宿主细菌来阻止噬菌体复制。噬菌体排斥系统通过阻断噬菌体附着起作用，而毒素-抗毒素系统调节细菌应激反应，确保噬菌体攻击下的细胞存活。

在这些防御机制中，CRISPR/Cas系统作为一个特别多功能的工具脱颖而出。CRISPR/Cas9系统是一种代表性的II-A型CRISPR/Cas系统，已广泛用于精确基因组编辑的遗传工程。该系统允许细菌将先前噬菌体感染的DNA片段整合到其基因组中，提供适应性免疫。当同一噬菌体再次感染时，细菌产生crRNA，引导Cas9蛋白靶向病毒DNA，导致其降解。CRISPR/Cas9系统的精确性和适应性使其成为基础研究和工业应用的宝贵工具，能够实现对特定噬菌体的靶向抗性。

其他有效的防御策略涉及改变或掩蔽细菌表面受体以及使用诱饵受体来防止噬菌体附着。这种方法简单、直接且有效，允许细菌逃避噬菌体感染，而无需复杂的遗传改变。修饰其表面结构的细菌可以快速适应噬菌体攻击，这使得该策略在波动环境中用于短期抗性具有优势。

在本研究中，研究人员从受污染的发酵样品中分离出一种新型烈性大肠杆菌噬菌体，命名为TR2。该噬菌体有效感染了工业相关菌株大肠杆菌BL21(DE3)，严重破坏了发酵过程。通过对TR2的全面表征和基因组分析，研究人员构建了两种类型的工程化抗噬菌体大肠杆菌菌株：一种利用噬菌体受体基因的自发突变来阻断吸附，另一种采用基于CRISPR/Cas9的靶向免疫系统。他们系统地比较了它们的噬菌体抑制效率、广谱抗性和遗传稳定性。这项工作为开发高效稳定的抗噬菌体菌株提供了理论支持和实践指导，为控制工业发酵系统中的噬菌体污染提供了可行的解决方案。

结果

大肠杆菌噬菌体TR2的形态

BL21(DE3)是工业发酵中广泛使用的模型微生物，作为噬菌体分离的宿主。从发酵底物中成功分离到一株烈性噬菌体，命名为TR2。它在野生型BL21(DE3)菌苔上形成圆形、透明的噬菌斑，平均直径为6.42 ± 1.32毫米。透射电子显微镜分析显示，TR2具有一个直径为50纳米的衣壳和一个长度为10纳米的短尾，头尾比达到500%。TR2的TEM图像显示出典型的短尾噬菌体形态。

噬菌体TR2的生物学特性

使用效率平板法评估了噬菌体TR2对27种不同细菌菌株的宿主范围。结果表明，噬菌体TR2仅对大肠杆菌菌株表现出裂解活性。相反，它不能裂解铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌和金黄色葡萄球菌。值得注意的是，在12株大肠杆菌中，TR2表现出很强的特异性，仅靶向BL21(DE3)和DH5α，而对其他测试的大肠杆菌菌株无效。

为了确定噬菌体TR2的最佳感染复数，研究人员在MOI为10、1、0.1、0.01和0.001的条件下感染BL21(DE3)细胞。感染6小时后，在MOI为0.1时观察到最高噬菌体滴度，为3.5 × 10⁹ PFU/mL，表明0.1是最佳MOI。随后，研究人员在最佳MOI下构建了噬菌体TR2的一步生长曲线，分析显示其潜伏期短至10分钟，平均裂解量为77 PFU/细胞，突出了该噬菌体的快速复制和强大裂解能力。

研究人员研究了噬菌体TR2在不同pH和温度条件下的环境稳定性。TR2对酸性和碱性环境表现出显著的耐受性，在pH 5.0–11.0暴露1小时后仍能保持50%以上的活性。然而，在pH ≤4或pH ≥12时，噬菌体几乎完全失活。热稳定性评估表明，在20至37°C的温度范围内暴露30分钟，噬菌体滴度没有显著变化。在高于50°C的温度下，噬菌体活性以温度依赖性方式显著下降。

TR2的基因组特征和系统发育分析

TR2基因组是一个线性双链DNA，总长度为45,171 bp，G+C含量为44%。噬菌体TR2的完整基因组包含74个预测的开放阅读框，其中43个具有明确或推定的功能注释，而31个被归类为假设蛋白。基因组分析证实不存在抗生素抗性基因、毒力因子和溶原性元件。基于功能注释，这些ORF可分为七个主要功能模块，包括结构组件、DNA包装、复制、裂解、调控、tRNA相关功能和假设蛋白。每个模块中的代表性基因，如大、小终止酶亚基、主要衣壳蛋白、holin、溶菌酶和spanin，都是基于序列同源性预测的。这些基因的完整功能注释在附表S2中提供。

比较分析使用在线工具BLASTN进行，结果显示噬菌体TR2与大肠杆菌噬菌体CY1_Cui-2023具有最高同源性，显示出92%的基因组覆盖度和99.69%的序列一致性。基于37个与噬菌体TR2高度同源的噬菌体的完整基因组序列构建了系统发育树。噬菌体TR2与大肠杆菌噬菌体CY1_Cui-2023聚集在同一分支。根据VICTOR分类，该分支中的所有噬菌体都属于同一科Drexlerviridae和同一亚科Braunvirinae。

计算了37个噬菌体基因组的平均核苷酸同一性，并使用热图可视化以说明基因组相似性。与噬菌体TR2相比，大肠杆菌噬菌体CY1_Cui-2023呈现出最高的ANI值，为95.5%。由于与噬菌体TR2具有高度序列相似性，选择大肠杆菌噬菌体CY1_Cui-2023和vB_EcoS_IME542进行比较基因组分析。这三个噬菌体在其结构蛋白中共享高度相似的保守框架。发现噬菌体TR2的基因组缺乏抗生素抗性基因、毒力因子和溶原性元件，表明其具有良好的生物安全性特征。此外，使用PhageTerm工具的分析表明，TR2采用典型的Pac型DNA包装机制，包装起始位点位于正链的核苷酸位置18,637。

自发突变抗噬菌体菌株的突变分析

为了研究对噬菌体TR2产生抗性的遗传基础，对两个自发突变的抗噬菌体菌株BL21(DE3)-N-1和BL21(DE3)-N-2进行了全基因组测序。突变分析揭示了这些菌株中不同的遗传改变。在BL21(DE3)-N-1中，一个777 bp的缺失破坏了一个IS1A家族转座酶和2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因。在BL21(DE3)-N-2中，鉴定出两个突变：一个是在编码LPS转运蛋白LPTA的基因中的一个点突变（A→G），另一个是在编码LPS 1,2-葡萄糖基转移酶（LPS合成的核心酶）的基因中的一个碱基缺失。基因组分析表明，BL21(DE3)-N-2的噬菌体抗性可能源于LPTA基因和编码LPS 1,2-葡萄糖基转移酶的基因突变。这些改变可能修饰了表面受体的结构或分布，从而损害了噬菌体的识别和吸附。相比之下，虽然在BL21(DE3)-N-1中鉴定出了IS1A转座酶和ISPD基因的突变，但目前没有直接证据将这些突变与受体结构的改变联系起来。此外，吸附试验证实，与野生型BL21(DE3)相比，两种突变体对噬菌体TR2的吸附显著减少或完全消失。这些结果表明，关键受体相关基因的自发突变会损害噬菌体吸附，使细菌能够通过受体位点的修饰或丢失来逃避噬菌体感染。

抗噬菌体菌株的抗噬菌体活性

为了评估噬菌体抗性，研究人员比较了自发突变抗噬菌体菌株和CRISPR/Cas9工程重组菌株的抗噬菌体活性。EOP测定表明，两种策略都赋予了野生型BL21(DE3)不同程度的噬菌体抗性。当针对一组十种噬菌体进行测试时，BL21(DE3)-N-1表现出广谱抗性，对八种噬菌体菌株的感染降低了超过四个数量级。相比之下，CRISPR/Cas9菌株表现出强大但范围较窄的保护作用，特别是对与TR2具有高度序列相似性的噬菌体TR1显示出增强的抗性。这些结果表明，自发突变的抗噬菌体菌株对不同的噬菌体群体具有更广的拮抗谱，而工程化的CRISPR/Cas9重组菌株则提供强大但噬菌体特异性的保护。

为了评估噬菌体抗性的稳定性，研究人员进行了三个连续的共培养循环。在与自发突变抗噬菌体菌株BL21(DE3)-N-1和BL21(DE3)-N-2进行三轮适应性共进化后，分别分离到进化出的噬菌体变体TR2-E-1和TR2-E-2。TR2-E-1和TR2-E-2在ORF50（尾尖蛋白）中共享相同的非同义突变G24084A。相比之下，在与工程化CRISPR/Cas9重组菌株共培养三轮后，未观察到噬菌体逃逸变体，表明工程化CRISPR/Cas9重组菌株能提供更稳定、更持久的防御，以抵抗噬菌体感染。

噬菌体抗性、生长抑制和重组蛋白生产

为了评估在噬菌体压力下的抗性表现，研究人员在不同MOI下监测了自发突变抗噬菌体菌株和工程化CRISPR/Cas9重组菌株在噬菌体TR2攻击下的生长情况。两种工程化的CRISPR/Cas9重组菌株在MOI为1、0.1和0.01时均表现出对噬菌体TR2的显著抗性，尽管它们的生长受到MOI依赖性的中度抑制。在自发突变菌株中，BL21(DE3)-N-1在所有测试的MOI（包括MOI为10）下都表现出完全抗性，而BL21(DE3)-N-2则表现出明显的生长抑制。这些结果证实了两种策略都能赋予噬菌体抗性，其中BL21(DE3)-N-1在高噬菌体压力下提供了最强大和最稳定的保护。

为了评估与噬菌体抗性相关的潜在适应性代价，研究人员在无噬菌体条件下评估了细菌的生长。BL21(DE3)-N-1的生长与野生型BL21(DE3)相当，表明没有检测到适应性负担。然而，BL21(DE3)-N-2表现出生长减缓，其OD₆₀₀在培养12小时后仅达到对照的78.25%。CRISPR/Cas9重组菌株的生长也受到轻微影响，其OD₆₀₀约为对照的90%。此外，诱导CRISPR/Cas9系统对细胞生长影响极小，诱导和未诱导培养物之间的差异小于2%，表明代谢负担较低。

最后，研究人员检查了这些抗性策略对重组蛋白生产的影响。使用T7表达系统，研究人员构建了质粒pET28a(+)-603helicase来表达噬菌体DNA解旋酶蛋白（约49.02 kDa）。SDS-PAGE和Western blot分析显示，自发突变抗噬菌体菌株和工程化CRISPR/Cas9重组菌株中的重组蛋白产量与野生型BL21(DE3)菌株相当。这些结果表明，两种抗性策略都不会对重组蛋白生产能力产生不利影响。这些发现强调，两种策略都成功地赋予了对噬菌体感染的抗性，同时保持了细菌生长和重组蛋白产量，证明了它们在工业应用中的可行性。

讨论

噬菌体污染仍然是工业发酵中的一个关键挑战，影响生产质量并导致重大经济损失。因此，开发抗噬菌体细菌菌株是一种有前景的替代策略。在细菌和噬菌体之间持续的进化“军备竞赛”中，细菌已经进化出多种防御机制。其中，CRISPR/Cas9系统已被改造为精确基因组编辑的遗传工具，同时保留了其作为适应性免疫防御的原始功能。此外，细菌可以通过自发突变改变、掩蔽或消除噬菌体受体，使其对入侵的噬菌体无法识别，从而产生噬菌体抗性。

在本研究中，研究人员首先分离并鉴定了噬菌体TR2，这是一种具有强大环境稳定性、短潜伏期和高裂解活性的烈性大肠杆菌噬菌体，这使其对发酵过程构成重大威胁。TR2的基因组测序为了解其遗传组成提供了关键见解，并为开发可编程的噬菌体抗性策略奠定了基础。为了对抗TR2污染，研究人员通过两种不同的策略成功构建了抗噬菌体BL21(DE3)菌株：（i）自发突变，即细菌通过受体修饰获得噬菌体抗性；（ii）CRISPR/Cas9介导的免疫，提供靶向遗传防御。

自发突变的抗噬菌体菌株和工程化的CRISPR/Cas9重组菌株都表现出对噬菌体TR2的强抗性。自发突变体BL21(DE3)-N-1显示出最高的噬菌体抗性，表现为噬菌斑完全缺失。然而，已鉴定的突变位点（IS1A转座酶和ISPD基因）与噬菌体受体没有明确建立的联系，其潜在机制需要进一步研究。此外，该策略受限于其随机性，意味着不同的突变可能赋予不同水平的抗性。相比之下，CRISPR/Cas9系统通过精确识别和降解噬菌体DNA来提供靶向的噬菌体抗性。虽然工程化的CRISPR/Cas9重组菌株也对TR2具有抗性，但它们在广谱噬菌体防御方面效率较低，因为它们的保护作用是序列特异性的。这突显了一个权衡：自发突变可能提供更广泛的保护，但可预测性较差；而CRISPR/Cas9提供稳定且可编程的免疫，但可能需要针对特定噬菌体进行靶向设计。

尽管赋予了抗性，但两种策略对细菌生长产生了不同的影响。BL21(DE3)-N-2表现出显著的生长延迟，表明受体突变可能干扰基本的细菌功能，如营养摄取或膜稳定性。工程化的CRISPR/Cas9重组菌株虽然略有受损，但比自发突变体保持了更好的生长适应性。有趣的是，CRISPR/Cas9系统的表达并没有带来显著的代谢负担，因为诱导和未诱导菌株之间没有差异。这一发现与之前的一些报道形成对比，那些报道中维持CRISPR介导的防御系统需要高能量消耗。这种差异可能是由于质粒表达水平的差异或大肠杆菌BL21(DE3)的代谢适应性造成的。这些结果表明，自发突变可能由于意外的基因破坏而损害细菌生长，而基于CRISPR/Cas9的菌株保留了更高的生长效率，使其成为大规模发酵的更可行选择。

为了评估两种策略的长期有效性，研究人员在多个培养周期中进行了噬菌体抗性稳定性测定。经过三轮共培养后，噬菌体TR2恢复了感染自发突变菌株的能力，表明基于受体的抗性机制可能驱动细菌和噬菌体之间的军备竞赛。这与先前的发现一致，即噬菌体可以通过尾部纤维发生突变来规避宿主细胞的受体修饰，从而维持其感染宿主的能力。相比之下，在工程化的CRISPR/Cas9重组菌株中没有观察到噬菌体逃逸突变体，表明基于序列的免疫随时间推移更加稳健和稳定。这一发现意义重大，因为它证明了工程化的CRISPR/Cas9重组菌株不易受噬菌体适应的影响，使其成为长期工业应用中更可靠的策略。

对工业大肠杆菌菌株的一个关键要求是其在保持噬菌体抗性的同时，能够高效表达重组蛋白。研究结果表明，尽管存在轻微的适应性权衡，但两种噬菌体抗性策略都保持了与野生型菌株相当的重组蛋白产量。T7驱动的DNA解旋酶的蛋白质生产水平在野生型、自发突变抗噬菌体和工程化CRISPR/Cas9重组菌株之间没有显著差异。这一发现至关重要，因为它表明引入噬菌体抗性机制不会损害生物生产效率。这与其他报道形成对比，那些报道中遗传修饰导致代谢效率降低。本研究中蛋白质生产的稳定性可能归因于CRISPR/Cas9维持的相对较低的代谢负担以及BL21(DE3)作为稳健表达宿主的适应性。

本研究系统地比较了自发突变和CRISPR/Cas9介导的免疫作为两种工程化抗噬菌体大肠杆菌菌株的策略。自发突变提供广谱抗性，但以适应性和进化稳定性为代价，而CRISPR/Cas9确保长期、可编程的免疫，且生长缺陷最小。重要的是，两种策略都成功地保护了细菌培养物免受噬菌体感染，且不影响重组蛋白生产，凸显了它们在工业应用中的潜力。鉴于稳定性、特异性和代谢负担之间的权衡，未来的研究应侧重于整合多种防御机制，以开发下一代抗噬菌体微生物平台。这可能包括CRISPR/Cas9与受体修饰的组合，或利用抗CRISPR抑制剂来对抗噬菌体适应，确保可持续和高效的发酵过程。

本研究中噬菌体TR2的生物学特性是基于经验比较进行的，结果应解释为特定实验条件下的相对最优值，而非绝对的通用标准。此外，值得注意的是，本研究中构建的CRISPR/Cas9系统基于商业化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，该菌株因其强大的遗传可操作性和实验可控性而广泛用于合成生物学和蛋白质表达研究。在此背景下，引入编码CRISPR/Cas9系统的外源质粒并不会实质性改变该特定宿主菌株的基本生物学特性。然而，当将此方法应用于其他细菌宿主时，可能会产生携带外源功能元件的重组菌株，这些菌株被归类为转基因生物，因此受到更严格的监管审查。因此，为确保该系统的更广泛应用，未来的研究应进一步评估其生物安全性，并根据实际应用需求考虑当前的生物工程伦理和监管框架。