T9SS组分蛋白SprA的C端结构域协助嗜冷黄杆菌噬菌体内溶素Ely174裂解革兰氏阴性菌的机制研究

《Applied and Environmental Microbiology》：The C-terminal domain of T9SS component protein SprA assists Flavobacterium psychrophilum bacteriophage endolysin Ely174 to lyse Gram-negative bacteria

本刊推荐一篇关于噬菌体内溶素（endolysin）工程化改造的创新性研究。该研究聚焦于嗜冷黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum）噬菌体内溶素Ely174，通过随机突变与理性设计相结合的策略，显著提升了其裂解活性与热稳定性。尤为重要的是，研究首次将IX型分泌系统（T9SS）组分蛋白SprA的C端结构域（CTD）与Ely174融合，成功赋予其穿透革兰氏阴性菌外膜（OM）的能力，为开发针对含T9SS病原菌的新型抗菌剂提供了全新视角。

　　

ABSTRACT

嗜冷黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum）是引起细菌性冷水病（BCWD）的病原体，给水产养殖业造成巨大经济损失。使用抗生素控制嗜冷黄杆菌存在产生耐药菌株的风险。利用噬菌体来源的内溶素作为抗生素的有效替代品是当前的研究热点。本研究异源表达了嗜冷黄杆菌噬菌体的内溶素Ely174。使用2.5 μg/mL的Ely174可在约6分钟内将经Triton预处理的嗜冷黄杆菌在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）从0.8降至0.2。除了广泛的pH耐受范围外，Ely174还显示出广谱的宿主范围。反应体系中存在Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺可增强其杀菌活性。通过随机突变，Ely174的裂解活性提高了三倍。通过理性设计改善了嗜冷内溶素Ely174的热稳定性。最终的叠加突变产生了变体A39H/P48I/E144A，即使在50°C热处理2小时后，仍能快速裂解预处理的嗜冷黄杆菌。IX型分泌系统（T9SS）参与拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌的致病机制。将内溶素Ely174与T9SS组分蛋白SprA的C端结构域（CTD）融合，使Ely174-CTD_SprA能够裂解未经处理的嗜冷黄杆菌。与ABC转运透酶重组可帮助内溶素Ely174克服革兰氏阴性菌的外膜屏障。这些结果表明内溶素Ely174作为水产养殖和食品工业中抗菌剂的潜力。对内溶素Ely174的蛋白质工程也为控制含T9SS的细菌提供了新的视角。

INTRODUCTION

黄杆菌属（Flavobacterium）广泛分布于土壤、水和空气中。其中一些种类是鱼类病原体，如嗜冷黄杆菌和柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）。革兰氏阴性菌嗜冷黄杆菌是鲑科鱼类的主要病原体。由嗜冷黄杆菌感染引起的虹鳟鱼细菌性冷水病通常导致尾鳍侵蚀、背鳍损伤、脾脏肿大、肠炎和腹水。虹鳟鱼鱼苗因毁灭性嗜冷黄杆菌感染的死亡率高达90%。香鱼、海七鳃鳗等非鲑科淡水鱼也受嗜冷黄杆菌影响。嗜冷黄杆菌的垂直和水平传播增加了BCWD的流行率。嗜冷黄杆菌给水产养殖业造成的经济损失不容忽视。大多数能有效控制BCWD爆发的抗生素不允许在食品工业中使用。此外，抗生素的大量使用导致了耐药嗜冷黄杆菌的出现。抗生素残留造成的环境污染和食品安全问题是全球关注的问题。因此，迫切需要寻找除抗生素以外的有效方法来预防和控制嗜冷黄杆菌的传播。

噬菌体及其衍生物目前被研究作为抗生素的潜在替代品。噬菌体编码的内溶素通过裂解宿主细菌细胞来释放子代噬菌体。肽聚糖（PG）层是革兰氏阳性菌细胞壁和革兰氏阴性菌细胞被膜的高度保守成分，是内溶素水解的主要位点。内溶素独特的靶向机制使其成为一种有前景的新型有效替代抗菌剂，以应对耐药细菌。几种针对革兰氏阳性菌的内溶素因其高裂解效率和不存在细菌耐药性风险已进入临床试验阶段。然而，外膜（OM）的存在保护了革兰氏阴性菌的PG层免受外源性内溶素的攻击。除了寻找具有OM渗透性的内溶素来对抗革兰氏阴性菌的增殖外，通常还采用与柠檬酸、氯仿、Triton、乙二胺四乙酸（EDTA）等OM透化剂（OMP）组合、与跨膜肽或阳离子肽融合、或封装在具有穿透特性的材料中等方法来提高靶向革兰氏阴性菌的内溶素的OM渗透性。成功克服OM屏障将扩大内溶素的应用范围。

有效抑制革兰氏阴性菌通常需要高剂量的内溶素。大多数游离内溶素对外部环境因素敏感，如离子浓度、血清和pH。相当数量的内溶素在高温下容易失活。因此，内溶素的实际应用受到制剂、储存和运输固有挑战的阻碍。研究人员试图寻找更有效的方法来改造内溶素并改善其特性。多序列比对通常用于识别内溶素的保守区域和参与其裂解活性的关键残基位点。基于三维结构分析、分子动力学模拟和计算，预测并突变内溶素的氨基酸位点，通过理性设计获得所需的酶学性质。例如，点突变促进了溶素PlyAB1的裂解活性和热稳定性。先前的研究主要集中在对沙门氏菌（Salmonella）、大肠杆菌（Escherichia coli）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）等常见食源性和临床病原菌的内溶素进行分子修饰。然而，关于改造内溶素以对抗水产养殖细菌疾病的报道很少。

IX型分泌系统（T9SS）仅存在于拟杆菌门（Bacteroidetes）成员中。至少有24种蛋白质参与T9SS的功能。跨周质空间运动复合物由GldK、GldL、GldM和GldN组成。SprA在OM上形成一个大的β-桶状结构，作为T9SS货物蛋白传导通道。T9SS的其他组分参与货物蛋白的调控、加工和修饰。大多数底物的保守C端结构域将其靶向T9SS易位子。T9SS及其货物蛋白在病原菌的致病机制中起关键作用。嗜冷黄杆菌的T9SS负责毒力、粘附、生物膜形成以及用于滑行或生物大分子降解的蛋白质的分泌。将内溶素与细菌的膜转运结构域融合可以增加OM渗透性。然而，T9SS来源元件与内溶素的组合尚未有研究。细菌素与内溶素的结合也已在无OMPs的情况下成功用于控制病原体。将内溶素与其他功能蛋白重组以改善其特性的研究尚待充分开发。

本研究表达了嗜冷黄杆菌噬菌体内溶素Ely174，并表征了其杀菌效果和酶学性质。此外，通过随机突变和理性设计相结合的方法提高了Ely174的裂解活性和热稳定性。此外，与功能蛋白共表达或与T9SS元件融合使得工程化内溶素Ely174能够在没有OMP辅助的情况下对革兰氏阴性菌发挥杀菌活性。这些发现有助于开发用于控制集约化水产养殖中病原体的内溶素。

RESULTS

内溶素Ely174的表达与裂解活性

噬菌体及其衍生物在控制毁灭性鱼类病原体方面具有巨大潜力。嗜冷黄杆菌噬菌体6H的基因组信息于2013年公布。然而，与其裂解嗜冷黄杆菌能力相关的内溶素尚未得到深入研究。噬菌体6H的内溶素由174个氨基酸组成，因此被命名为内溶素Ely174。将含有Ely174编码区的重组质粒在大肠杆菌BL21中表达。诱导表达和纯化后，获得了对应于内溶素Ely174分子量（19.2 kDa）的蛋白条带。

由于OM的不渗透性，大多数外源性内溶素需要OMPs的帮助才能有效清除革兰氏阴性菌。采用比浊法评估了内溶素Ely174的杀菌活性。使用从中国患病虹鳟鱼中分离的嗜冷黄杆菌JC进行检测。加入2.5 μg/mL内溶素Ely174后，经Triton预处理的嗜冷黄杆菌的OD₆₀₀在6分钟内从0.85降至0.2。当向对照组加入相同体积的Tris-HCl缓冲液时，Triton预处理的嗜冷黄杆菌的OD₆₀₀值没有显著变化。菌落形成单位（CFU）计数显示，与内溶素Ely174孵育3分钟后，Triton预处理的嗜冷黄杆菌降至3.0 log。此外，Ely174能够在反应10分钟后杀死6.3 log的Triton预处理的嗜冷黄杆菌。结果表明，内溶素Ely174能有效清除经Triton预处理的嗜冷黄杆菌。

为了检测内溶素Ely174的裂解能力，使用透射电子显微镜（TEM）观察嗜冷黄杆菌的形态变化。天然嗜冷黄杆菌的细胞表面完整且光滑。经Triton处理后，嗜冷黄杆菌轮廓模糊，但细菌保持完整。然而，在存在内溶素Ely174的情况下，嗜冷黄杆菌细胞出现松散、变形和破裂。在观察视野中清晰可见释放的细胞内容和细胞碎片。这些结果表明Ely174在裂解Triton预处理的嗜冷黄杆菌方面具有高效活性。

内溶素Ely174的最适温度与pH

嗜冷物种中已经并持续鉴定出嗜冷酶。鉴于蛋白酶的性质，有必要确定Ely174活性的最适温度。在4°C至55°C温度范围内进行的测试表明，Ely174在20°C时显示出最高的裂解活性。30°C至40°C的温度对Ely174的活性有一定不利影响，相对酶活性降至约50%。内溶素Ely174的杀菌活性在55°C时几乎完全丧失。然而，内溶素Ely174在pH 3.0至12.0范围内均有活性，其抗菌活性的最适pH为8.0。在pH 9.0至11.0时，相对酶活性保持在90%以上，而在pH 4.0至7.0时，裂解活性下降约50%。结果表明，内溶素Ely174的酶活性在碱性条件下增强。

阳离子和血清对内溶素Ely174裂解活性的影响

脂多糖是OM的带负电荷成分，对革兰氏阴性菌OM的稳定性起关键作用。反应体系中的正离子影响宿主细菌OM的稳定性和内溶素的杀菌活性。阳离子降低了内溶素XFII对大肠杆菌的裂解效率。因此，向内溶素Ely174的反应缓冲液中添加各种阳离子，以测试酶活性是否受到影响。与缺乏这些阳离子的反应体系相比，添加Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺增强了内溶素Ely174的抗菌效率。在Ca²⁺存在下，内溶素Ely174的酶活性至少增加了一倍。K⁺和Mn²⁺降低了内溶素Ely174裂解嗜冷黄杆菌的能力。这些结果表明内溶素Ely174对反应体系中的正离子敏感。感染嗜冷黄杆菌的鱼皮肤常发生溃疡。血清已被鉴定为生理条件下内溶素失活的主要原因。当反应缓冲液中加入10%牛血清时，内溶素Ely174的裂解活性增加了约20%。添加30%牛血清则抑制了Ely174的酶活性。结果表明，内溶素Ely174可以耐受低浓度的牛血清。

内溶素Ely174的宿主谱

革兰氏阴性菌PG层的相似性可能是许多内溶素具有广谱宿主范围的原因之一。使用嗜冷黄杆菌DSM 3660、河流黄杆菌（F. amnicola）、伯纳德特黄杆菌（F. bernardetii）、胶冻黄杆菌（F. geliluteum）、食鱼金黄杆菌（Chryseobacterium piscicola）、巴氏金黄杆菌（C. balustinum）、鳟鱼金黄杆菌（C. oncorhynchi）等11种水生细菌评估了内溶素Ely174的杀菌能力。13株经Triton预处理的菌株可被内溶素Ely174有效裂解。此外，细胞浓度的快速下降表明易变黄杆菌（F. facile）和巴氏金黄杆菌对Ely174更敏感。相比之下，对鱼类病原体嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的抗菌效率相对较低。这些结果表明了内溶素Ely174的广谱裂解范围。

内溶素Ely174的随机突变提高其裂解活性

使用AlphaFold进一步了解内溶素Ely174的特性。以T7溶菌酶的蛋白质结构为模板对Ely174进行同源建模。T7溶菌酶（由大肠杆菌噬菌体编码）属于N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶家族。T7溶菌酶和Ely174的序列比对显示它们的保守区域具有一定程度的相似性。随机突变是构建突变体库的基础，对于在定向分子进化中鉴定具有特定性状的蛋白质不可或缺。随机选择内溶素Ely174的氨基酸残基Met66、Met119、Phe126和Glu144进行突变分析。改变Met66或Met119严重降低了内溶素Ely174的抗菌效力。在四个变体中，只有E144A表现出裂解活性的显著增加。变体E144A的酶活性是内溶素Ely174的三倍。结果表明，随机诱变是增强内溶素Ely174杀灭效率的一种途径。

内溶素Ely174热稳定性的改善

内溶素的热稳定性对其加工和应用非常重要。在不同温度下处理2小时后测量Ely174的裂解活性。水产养殖环境的典型温度低于30°C。观察到当预处理温度为30°C时，内溶素Ely174的相对酶活性保持在45%。在35°C处理2小时将抗菌活性降低至20%。因此，有必要提高内溶素Ely174的热稳定性以扩大其应用。

使用HotSpot Wizard 3.0分析了Ely174的模拟结构。基于序列一致性和氨基酸频率，设计了可能具有改善热稳定性的内溶素Ely174变体。分析了10个单点突变体的裂解活性。与内溶素Ely174相比，变体S23A、A39H、P48I和A135I在20°C下的杀菌活性有所增加。其他突变体的裂解活性等于或低于内溶素Ely174。此外，在35°C预处理2小时后，突变体S23A、A39H、P48I和A135I的相对酶活性分别比内溶素Ely174提高了3.2倍、3.6倍、1.5倍和3.6倍。值得注意的是，突变体A39H的热稳定性显著提高。在45°C预处理2小时后，A39H的裂解活性在所有变体中最为有效。为了进一步提高Ely174的热稳定性，进行了双位点组合诱变。双点变体A39H/P48I在35°C预处理2小时后的裂解活性比A39H提高了45%。然而，突变体A39H/A135I的酶活性并不优于A39H。在相同条件下，突变体S23A/A39H完全丧失了杀菌活性。这两个位点的突变可能影响了内溶素的空间构象。

通过随机诱变获得了具有显著裂解活性的变体E144A。为了增加Ely174变体在高温下的裂解活性，进行了叠加突变。与突变体A39H/P48I相比，三点变体A39H/P48I/E144A在45°C或50°C处理2小时后显示出更高的杀菌活性。特别是在45°C预处理条件下，变体A39H/A135I/E144A的裂解活性是A39H/P48I的1.5倍。结果表明，随机突变和理性设计的结合有效提高了内溶素Ely174的热稳定性。变体A39H/P48I/E144A具有增强的裂解活性和热稳定性，从而增加了其未来应用的潜力。

内溶素Ely174的蛋白质工程改善其OM渗透性

革兰氏阴性菌的OM限制了大多数不具备膜穿透能力的内溶素的功能。靶向OM受体的肽可以成功地将内溶素递送至宿主细菌的PG层。T9SS是最近发现的蛋白质分泌系统，SprA在含T9SS细菌的OM上形成关键通道。然而，T9SS与内溶素的组合尚未见报道。为了解决这个问题，将SprA的C端结构域与内溶素Ely174融合，以验证T9SS元件是否能增加外源性内溶素的OM渗透性。如图所示，在无Triton预处理的情况下，工程化内溶素Ely174-CTD_SprA能够裂解天然的嗜冷黄杆菌细胞。加入100 μg/mL Ely174-CTD_SprA后50分钟内，嗜冷黄杆菌的OD₆₀₀从1.00降至0.40。尽管Ely174-CTD_SprA的裂解速率较慢，但结果表明SprA的C端结构域协助内溶素进入嗜冷黄杆菌的PG层以发挥其杀菌功能。

ABC转运透酶具有运输或结合蛋白质的能力。WP_011964122是嗜冷黄杆菌中保守的ABC转运透酶之一。当内溶素Ely174连接到WP_011964122的C端时，重组内溶素Permease-Ely174在50分钟内将未经Triton处理的嗜冷黄杆菌细胞的OD₆₀₀从0.90降至0.60。透酶WP_011964122对于内溶素Ely174克服嗜冷黄杆菌的OM屏障非常重要。两种重组内溶素在低浓度下表现出相对较弱的杀菌能力。这些结果表明，通过蛋白质工程可以改善内溶素Ely174的OM渗透性。

DISCUSSION

细菌感染是水产养殖疾病爆发的主要原因之一。第一株嗜冷黄杆菌于1948年从虹鳟鱼中分离出来。随后，在鲑科和非鲑科鱼类等不同鱼种中均有发现。针对BCWD的商业疫苗开发进展缓慢。基于噬菌体裂解宿主细菌机制开发抗菌剂有助于减少抗生素的过度使用。越来越多的具有裂解嗜冷黄杆菌能力的噬菌体已被鉴定。与噬菌体不同，内溶素在接触PG层后立即发挥裂解活性，使得宿主细菌无法积累突变。此外，内溶素控制细菌的方式与抗生素不同，从而避免了耐药性风险。本研究探讨了嗜冷黄杆菌噬菌体内溶素Ely174的酶学性质。

革兰氏阴性菌的OM保护其PG层免受外部物质侵害。外源性内溶素对革兰氏阴性菌发挥酶活性的常见方法之一是与OMPs结合。通常使用不同浓度的EDTA来破坏细菌的OM。Triton可 destabilize 鲍曼不动杆菌的OM，从而使PlyAB1发挥其裂解活性。在存在内溶素Ely174的情况下，经Triton预处理的嗜冷黄杆菌的光密度在短时间内降至可检测的最低水平。嗜冷黄杆菌受损的细胞和泄漏的细胞内容物进一步证明了内溶素Ely174的杀菌能力。经Ely174处理的嗜冷黄杆菌的六张图像显示，裂解细胞的数量（152）超过了完整细胞的数量（63）。观察到约70%的嗜冷黄杆菌细胞正在发生裂解。尽管一部分嗜冷黄杆菌在Ely174存在下保持结构完整性，但可能有一小部分细胞处于可存活但不可培养的状态。蛋白质工程是提高内溶素OM渗透性的另一种有效方法。通常使用具有膜穿透特性的聚阳离子、疏水、两亲性肽将内溶素递送至宿主细菌的PG层。例如，将阳离子肽融合到Lysep3溶素的C端可以促进其在无OMPs共处理的情况下裂解大肠杆菌。细菌的转运系统和OM受体也被用作内溶素的膜渗透靶点。Colicin-Lysep3通过TolB机制接触大肠杆菌的PG层。OM蛋白SprA在拟杆菌门中形成T9SS货物蛋白转运和离子摄取的关键通道。SprA的C端结构域协助内溶素Ely174裂解未经预处理的嗜冷黄杆菌。值得强调的是，其他含T9SS的病原体可以类似方式得到控制。与OMP辅助的Ely174的裂解能力相比，重组内溶素Ely174-CTD_SprA需要更高浓度才能杀死天然嗜冷黄杆菌。研究还发现，需要高浓度（100 μg/mL）的重组内溶素pesticin-T4才能穿透大肠杆菌的OM。此外，相当一部分工程化内溶素需要相对较长的作用时间才能达到所需的杀灭效率水平。在进一步的研究中，应选择其他T9SS元件或SprA的合适区域来提高工程化内溶素的抗菌效率。ABC转运系统与细菌毒力相关。重组内溶素Permease-Ely174在无Triton预处理的情况下裂解了嗜冷黄杆菌。先前的研究报道，来自微鞘藻（Microcoleus chthonoplastes）的ABC转运透酶蛋白的结合可有效抑制白色念珠菌（Candida albicans）中的毒力因子天冬氨酰蛋白酶。探索嗜冷黄杆菌中其他具有转运功能的蛋白质可能为外源性内溶素穿透细菌OM提供额外途径。Ely174-CTD_SprA和Permease-Ely174有限的裂解活性初步表明，可以利用嗜冷黄杆菌的蛋白质分泌和转运系统来改造Ely174以增强其OM渗透性。

内溶素的裂解活性因其蛋白质性质而对