基于mRNA技术的OC43冠状病毒疫苗研发及其跨亚属交叉保护作用研究

《Journal of Virology》：Development of a cross-protective common cold coronavirus vaccine

本研究开发了一种表达稳定化OC43刺突蛋白的mRNA疫苗，在小鼠模型中证实其不仅能诱导特异性免疫反应，还能对仅具65%序列同源性的MHV-A59病毒产生交叉保护。通过被动免疫实验证明交叉保护主要由体液免疫介导，为泛冠状病毒疫苗开发提供了新策略。

　　

ABSTRACT

普通感冒冠状病毒如OC43和HKU1通常在健康人群中引起轻度呼吸道感染，但在免疫功能低下者和老年人中可能导致严重疾病。目前尚无临床批准的疫苗用于预防普通感冒冠状病毒感染。本研究开发了一种表达源自OC43冠状病毒的稳定化刺突蛋白的mRNA疫苗，并在C57BL/6小鼠的不同攻击模型中测试其效力。这种新型OC43疫苗不仅引发了OC43特异性免疫反应，还产生了针对其他Embecovirus（包括HKU1和小鼠肝炎病毒MHV-A59）的交叉反应性免疫反应。有趣的是，该疫苗不仅能保护小鼠免受致死性OC43感染，还能对抗远缘的Embecovirus——MHV-A59。这些发现为普通感冒冠状病毒疫苗的开发提供了见解，证明了其针对多种冠状病毒的保护潜力。

IMPORTANCE

像OC43这样的人类冠状病毒在易感人群中引起疾病，但目前尚无获批疫苗。我们开发了一种靶向OC43刺突蛋白的mRNA疫苗，该疫苗不仅能保护小鼠免受同源OC43攻击，还能对抗远缘的Embecovirus MHV-A59。这些发现证明了单一疫苗在同一亚属内对多种冠状病毒赋予广泛保护力的可行性，推进了泛冠状病毒疫苗的开发策略。

INTRODUCTION

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已导致全球超过700万人死亡。尽管死亡人数众多，但SARS-CoV-2疫苗的快速开发降低了疫情死亡率。除了SARS-CoV-2，几种地方性冠状病毒如OC43、229E、HKU1和NL63在人群中传播，导致频繁的再感染。虽然这些地方性冠状病毒通常引起轻度至中度上呼吸道感染，但它们也可能导致严重病症、肺炎和支气管炎，尤其是在老年人和免疫功能低下个体中。其中，人类普通感冒冠状病毒OC43在全球范围内引起频繁的呼吸道感染，但目前尚无有效疫苗可用。

OC43的广泛传播因其突变倾向和与其他冠状病毒的潜在重组而引发公共卫生关注。OC43可能对医疗系统造成负担，导致经济损失。OC43再感染的高发率进一步凸显了对有效疫苗的需求。用有效疫苗应对这些挑战不仅能改善人群整体健康，还有可能减轻与反复冠状病毒感染相关的经济负担。在此，我们开发了一种编码稳定化OC43刺突蛋白的mRNA疫苗。我们的结果表明，该疫苗具有免疫原性，不仅能有效对抗OC43，还能对远缘的Embecovirus提供高度保护。

RESULTS

Design of a novel mRNA-LNP vaccine encoding HCoV-OC43 spike glycoprotein (mRNA-OC43)

我们开发了一种编码OC43冠状病毒全长刺突糖蛋白的mRNA疫苗。我们使用了来自NCBI（AAA03055.1）的刺突蛋白序列，并在S2结构域的1070和1071氨基酸位置引入了两个脯氨酸突变（替换为A和L氨基酸），以将刺突蛋白稳定在其预融合状态。通过将密码子优化的刺突基因序列与3'和5'末端的非翻译区（UTR）以及编码序列3'末端前的T7 RNA聚合酶位点结合，设计了pcDNA3.1（+）质粒构建体。通过用相应mRNA转染HEK293T细胞，然后进行Western Blot分析验证蛋白表达，确认了OC43刺突糖蛋白的表达。随后使用Nanoassemblr将mRNA分子封装到脂质纳米颗粒中。

Immunogenicity and protective efficacy of mRNA-OC43 following homologous OC43 challenge

为了评估免疫原性，我们首先给C57BL/6小鼠肌肉注射3 μg的mRNA-OC43。疫苗接种后，我们使用以OC43刺突作为包被抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）和细胞内细胞因子 assay（ICS）测量血浆中的抗体和T细胞反应。mRNA-OC43疫苗引发了针对OC43刺突蛋白的有效抗体反应。此外，该疫苗通过ICS引发了CD8和CD4 T细胞反应。

为了检查疫苗效力，小鼠在接种后第2周鼻内攻击50 μL OC43神经毒性（NV）毒株（1×10¹⁰基因组拷贝）。每天监测小鼠的临床症状或体征、体重和死亡率的变化。攻击OC43后，未接种疫苗的小鼠表现出严重的体重减轻、严重的临床病理变化，存活率仅为20%。相比之下，接受OC43疫苗的小鼠没有体重减轻，存活率为100%，且没有疾病临床症状。

Protective efficacy of mRNA-OC43 following a heterologous coronavirus challenge

进一步，我们探究了mRNA-OC43疫苗是否能对另一种Embecovirus（MHV-A59）提供交叉保护。MHV-A59是一种经过充分研究的小鼠病毒。OC43和MHV-A59在其刺突蛋白中仅有约65%的序列同一性，这使得MHV-A59成为检验我们mRNA-OC43疫苗交叉保护作用的严格挑战模型。虽然MHV-A59不被认为对人类构成重大威胁，但它作为评估我们OC43疫苗保护广度的有用原理验证模型。

为了探究OC43疫苗的交叉保护效力，给小鼠肌肉注射3 μg的mRNA-OC43疫苗。接种后2周，小鼠腹腔内（i.p.）攻击2×10⁶空斑形成单位（PFU）的MHV-A59。所有小鼠在感染后都经历了体重减轻，但接种了mRNA-OC43疫苗的小鼠与对照组相比体重减轻显著较少。此外，mRNA-OC43疫苗接种小鼠的临床症状明显较轻。MHV感染在C57BL/6小鼠中非常短暂。在我们的实验中，所有小鼠在腹腔攻击后5-7天都能解决急性MHV感染而不会死于感染，无论免疫状态如何。因此，我们选择攻击后第3天作为评估接种小鼠病毒载量的最佳时间。所有小鼠在感染后第3天处死以评估组织中的病毒载量。重要的是，mRNA-OC43疫苗接种小鼠在肺、脑和肝脏中显示出增强的病毒控制。这些数据表明，mRNA-OC43疫苗对仅有65%抗原匹配的异源冠状病毒提供了交叉保护。

Humoral responses elicited by mRNA-OC43 confer cross-protection against MHV-A59

疫苗保护通常由体液和细胞反应介导。为了具体评估体液保护的作用，我们进行了被动免疫研究。首先，我们在第0天和第21天用mRNA-OC43疫苗免疫C57BL/6小鼠，然后在第35天收集免疫血浆。在过继转移之前，使用ELISA确认了免疫血浆中对OC43刺突抗原的特异性抗体滴度。这些mRNA-OC43免疫血浆也表现出对由HEK293T细胞裂解物编码的MHV刺突抗原的交叉反应性。每只受体小鼠通过腹腔注射接受800 μL混合血浆。对照小鼠接受来自幼稚动物的血浆。第二天，所有受体小鼠腹腔攻击2×10⁶ PFU的MHV-A59。连续三天监测小鼠的体重减轻和临床严重程度。我们在感染后第3天测定组织中的病毒载量。值得注意的是，接受免疫血浆的小鼠表现出体重减轻减少、临床症状较轻，并且肺（降低2.5倍）和肝脏（降低2.2倍）中的病毒载量显著降低，表明mRNA-OC43疫苗引发的抗体对MHV-A59感染提供了交叉保护。

接下来，我们研究了mRNA-OC43疫苗引发的T细胞是否有助于控制MHV-A59。为了评估CD8⁺ T细胞的作用，我们在感染时使用耗竭抗体将其耗竭。CD8⁺ T细胞耗竭对病毒控制没有显著影响。类似地，在单独的实验中，我们耗竭了CD4⁺ T细胞以确定它们是否削弱了疫苗保护。CD4⁺ T细胞耗竭也没有损害疫苗保护。这些数据表明T细胞对于mRNA-OC43疫苗对MHV的交叉保护是可有可无的，尽管需要澄清的是，耗竭抗体可能无法完全耗竭组织中的所有T细胞。此外，CD4和CD8 T细胞之间的功能补偿仍然是一个可能的解释。

mRNA-MHV vaccine confers heterologous protection against OC43

我们已经证明mRNA-OC43疫苗能对MHV提供异源保护。我们还进行了"反向"疫苗接种攻击研究。给小鼠肌肉注射mRNA-MHV疫苗，然后用致死剂量的OC43进行攻击。接种后第15天，测量了抗体和T细胞反应。正如预期，mRNA-MHV疫苗诱导了针对其匹配抗原（MHV刺突蛋白）的抗体反应。有趣的是，这种mRNA-MHV疫苗也引发了针对其他冠状病毒的交叉反应性抗体反应，包括OC43、HKU1和SARS-CoV-2。该疫苗引发了MHV特异性CD8⁺ T细胞反应（K^bS598），并且通过ELISpot assays也引发了交叉反应性OC43特异性CD8⁺ T细胞反应。

为了评估MHV疫苗的交叉保护效力，小鼠在接种后3周鼻内攻击OC43（NV毒株），然后监测体重减轻和临床评分。OC43攻击后，未接种疫苗的小鼠比接种疫苗的小鼠表现出更显著的体重减轻和更严重的疾病。与对照组相比，mRNA-MHV疫苗也有改善存活率的趋势，但差异无统计学意义。这些结果表明mRNA-MHV疫苗对远缘的OC43冠状病毒提供了部分保护。

DISCUSSION

有四种地方性人类冠状病毒通常引起轻度呼吸道感染。这包括两种甲型冠状病毒（HCoV-229E和HCoV-NL63）和两种乙型冠状病毒（HCoV-OC43和HKU1），它们都属于Embecovirus亚系。在本研究中，我们专注于OC43，因为有小鼠模型可用，并且它在人类普通感冒冠状病毒感染中占很大比例。OC43属于乙型冠状病毒属， alongside SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV，后者分别在2019年、2003年和2012年引发了疫情。

虽然先前的研究表明冠状病毒疫苗可以产生针对地方性冠状病毒的交叉反应性抗体，但尚不清楚这些抗体是否在体内具有交叉保护作用。在此基础上，我们假设一种针对人类普通感冒冠状病毒OC43的mRNA疫苗（目前尚无有效疫苗）也可能对其他冠状病毒赋予交叉保护。为了验证这一假设，我们开发了一种新型的编码稳定化OC43刺突蛋白的mRNA疫苗，并在体内评估其免疫原性和保护效力。这种mRNA-OC43疫苗引发了针对OC43的适应性免疫反应，并赋予了对OC43感染的保护，这是预期的，因为疫苗抗原与攻击抗原匹配。然而，一个有趣的发现是，mRNA-OC43疫苗也对MHV-A59提供了交叉保护，尽管OC43和MHV-A59在其刺突蛋白中仅有65%的同一性。值得注意的是，OC43疫苗诱导的抗体表现出与MHV刺突的交叉反应性。这种抗体介导的交叉反应性得到了过继血浆转移实验的进一步支持，该实验表明mRNA-OC43疫苗引发的抗体赋予小鼠对MHV感染的保护，强调了体液免疫在交叉保护中的重要性。有趣的是，与先前强调病毒特异性CD8⁺和CD4⁺ T细胞在交叉保护中关键作用的报告不同，我们的模型在MHV感染背景下未揭示这些T细胞亚群的交叉保护作用。"这可能是因为T细胞耗竭抗体无法到达所有组织，导致一些组织驻留记忆T细胞（Trms）未被耗竭"。此外，耗竭CD8 T细胞可能导致CD4 T细胞的功能补偿，反之亦然。

因此，我们研究中使用的耗竭抗体可能有效消除了血液中的T细胞，但未消除组织中的T细胞，可能掩盖了它们对交叉保护的贡献。

为了进一步证实我们的发现，我们给小鼠接种了一种编码MHV刺突蛋白的mRNA疫苗，并评估了其对OC43感染的保护效力。这也赋予了交叉保护，表现为接种动物体重减轻减少、临床症状较轻以及存活率提高。有趣的是，这种mRNA-MHV疫苗引发了对多种乙型冠状病毒的交叉结合抗体反应，包括OC43、HKU1和SARS-CoV-2，以及针对OC43刺突蛋白的交叉反应性T细胞反应。这些结果表明，针对单一冠状病毒毒株的疫苗可以对同一Embecovirus亚属内的其他冠状病毒赋予广泛保护。这些数据对于提高针对流行和新发冠状病毒的疫苗准备度可能很重要，例如，通过预先开发针对每个亚属代表性冠状病毒的疫苗。

MATERIALS AND METHODS

Mice and Immunizations

使用6至8周龄的C57BL/6小鼠。小鼠购自Jackson laboratories（大约一半雄性和一半雌性）。用稀释在无菌PBS中的mRNA-LNP（内部制备）对小鼠进行肌肉免疫。小鼠饲养在西北大学比较医学中心（CCM）。

Synthesis of modified mRNA

我们合成了编码HCoV-OC43（登录号AAA03055.1）密码子优化刺突蛋白和MHV-JHM毒株（登录号YP_209233.1）密码子优化刺突蛋白的mRNA疫苗。为了进行mRNA的体外转录（IVT-mRNA），设计了质粒构建体，将密码子优化的免疫原（OC43刺突或MHV刺突）、UTR和phase T7 RNA聚合酶启动子结合，并从Genscript购买。5'和3'-UTR的序列与先前出版物中使用的相同。使用修饰的核苷酸假尿苷-5'-三磷酸（ΨTP）以及经典核苷酸ATP、CTP和GTP从质粒构建体合成核苷修饰的IVT-mRNA。为了增强mRNA稳定性，使用CellScript加帽和加尾试剂盒在5'末端添加了N7-甲基鸟苷帽（Cap 1, m??G），并在3'末端加入了约150个核苷酸的poly（A）尾。通过乙酸铵沉淀纯化IVT-mRNA，并使用NanoDrop ONE分光光度计进行定量。为了评估蛋白表达，使用TransIT-mRNA转染试剂盒将纯化的mRNA转染到雌性人胚胎肾（HEK）293T细胞中。通过Western blot分析转染的HEK293T细胞的细胞裂解物以确认刺突蛋白表达。确认后，将mRNA封装在脂质纳米颗粒中，如下所述。

mRNA-LNP formulation

所有上述生成的纯化mRNA均使用NanoAssemblr Benchtop系统封装到脂质纳米颗粒中，并确认具有相似的封装效率（~95%）。简而言之，将mRNA稀释在50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中，以达到0.096 mg/mL的工作浓度。使用四种脂质——SM-102、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-PC、胆固醇和DMG-PEG，以50:10:38.5:0.38的摩尔比制备乙醇脂质混合物。随后，将水相中的稀释mRNA和脂质混合物通过微流体层流 cartridge运行。通过维持氮磷（N/P）比为4.0（脂质混合物与mRNA的比例为4），RNA与脂质流速比为3:1，总流速为12 mL/min来生成mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）。使用Amicon Ultra-15过滤单元和0.2 μm Acrodisc过滤器浓缩和纯化所得的mRNA-LNP。使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit确定封装效率和封装mRNA的浓度。

Reagents, flow cytometry, and equipment

为了确定血液和脾脏中的T细胞反应，如前所述制备外周血单个核细胞（PBMC）和脾脏的单细胞悬液。使用Live/Dead可固定死细胞染色剂门控掉死细胞。通过用OC43刺突肽池刺激脾细胞，在细胞内细胞因子染色（ICS）中测量针对OC43刺突的CD8和CD4反应。生物素化的MHC I类单体（K^bS598，序列RCQIFANI）用于检测MHV刺突特异性CD8 T细胞，从埃默里大学的NIH tetramer facility获得。用针对抗小鼠CD8α（53-6.7 on PerCP-Cy5.5）、抗小鼠CD4（RM4-5 FITC）、抗小鼠CD44（IM7 on Pacific Blue）、抗小鼠IFNγ（XMG1.2 on APC）、抗小鼠IL-2（JES6-5H4 on PE）和抗小鼠TNFα（MP6-XT22 on PE/Cyanine7）的荧光标记抗体对细胞进行染色。除抗CD44（来自Biolegend）外，荧光标记抗体均购自BD Pharmingen。使用LIVE/ DEAD可固定死细胞染色剂门控掉死细胞。使用Becton Dickinson Canto II或LSRII获取流式细胞术样本，并使用FlowJo v10进行分析。以下试剂通过BEI Resources, NIAID, NIH获得：肽阵列，人类冠状病毒OC43刺突（S）糖蛋白，NR-53728。

OC43 spike, HKU1 spike, SARS-CoV-2 spike, and MHV spike-specific ELISA

如前所述使用ELISA测量结合抗体滴度。简而言之，将96孔平底MaxiSorp板用0.1 mg/孔的相应刺突蛋白在4°C下包被24小时。为了检测MHV刺突特异性抗体反应，我们使用转染了编码MHV刺突的质粒的HEK293T细胞的裂解物作为包被抗原（在室温下孵育48小时）。用PBS + 0.05% Tween-20洗涤板。在室温下用200 μL PBS + 0.05% Tween-20 + 牛血清白蛋白进行封闭4小时。然后，将6 μL血清加入板第一列的144 μL封闭溶液中，对每个样品进行1:3系列稀释直至第12行，并将板在室温下孵育60分钟。洗涤板三次，随后加入在封闭溶液中稀释（1:5,000）的山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，每孔100 μL，并在室温下孵育60分钟。洗涤板三次，加入100 μL/孔的Sure Blue底物约8分钟。使用100 μL/孔的KPL TMB终止液终止反应。使用Spectramax Plus 384在450 nm处测量吸光度。使用从Addgene获得的哺乳动物表达载体内部生产OC43刺突蛋白。

Propagation and determination of OC43-NV titers

使用先前论文的方案，在1-2天龄的C57BL/6小鼠乳鼠中繁殖OC43-NV毒株。简而言之，给十只1-2天龄的小鼠脑内接种10 μL感染了OC43-NV的脑匀浆（由Stanley Perlman博士实验室惠赠）。2天后，从乳鼠收集全脑并在2 mL无菌PBS中匀浆。如前所述，通过以2,000 rpm离心10分钟澄清裂解物，并将上清液的小等分试样储存在-80°C。对于成年小鼠攻击，将上述病毒储备液稀释10倍，鼻内给予50 μL。通过定量实时RT-PCR靶向OC43核衣壳基因，使用TaqMan化学法如前所述定量脑裂解物中的病毒载量。

OC43-NV challenge and disease severity score

接种后第15天，给小鼠鼻内攻击50 μL OC43-NV毒株（1×10¹⁰基因组拷贝），每鼻孔25 μL。在3周内监测所有小鼠的体重减轻和临床严重程度。疾病严重程度按0到3的临床评分衡量，定义身体姿势、毛发外观、眼分泌物或闭合、动物活动性、嗜睡、体温和神经系统症状。最高分代表严重疾病状态，包括竖毛、蓬松外观、即使受到刺激也无反应且静止、严重弓背、眼睛完全闭合、停止进食/饮水、快速或呼吸困难并伴有喘息、体温过低、颤抖、对刺激无反应以及神经系统症状。2分定义为中度疾病，包括中度弓背、背部大部分毛发蓬乱、仅在受到刺激时活动、静止、对听觉无反应或对触摸反应缓慢、眼睛半闭、可能有眼分泌物、嗜睡、活动较少以及持续呼吸困难。轻度疾病评分为1分，表现为轻度弓背、毛发略微蓬乱、活跃、避免直立站立以及对听觉/触摸刺激反应缓慢。正常活跃、毛发光滑的动物评分为0分。

MHV propagation and quantification

MHV-A59的种子毒株来自ATCC。该病毒在17 CL-1细胞中繁殖，并在L2细胞上测定滴度（由Susan R. Weiss博士惠赠）。17 CL-1和L2细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM中传代。为了病毒繁殖，以低感染复数（MOI）0.1在1% DMEM中接种17 CL-1细胞。孵育72小时后，收集上清液并通过以2,000 rpm离心10分钟进行澄清。通过使用L2细胞单层进行空斑试验确定病毒储备液的滴度。为了确定感染组织中的病毒滴度，在攻击后第3天收集肺、肝和脑，并立即储存在-80°C直至处理。对于空斑试验，在10% DMEM培养基中，将每孔1×10⁶个L2细胞接种到6孔板中。24小时后，当单层细胞达到90%–100%融合时，将组织样本在37°C水浴中解冻并处理以评估病毒滴度。使用标准TissueRuptor匀浆器匀浆组织，在1% DMEM中制备匀浆样品的10倍系列稀释液，并滴加到细胞单层上。将6孔板置于37°C、5% CO₂培养箱中1小时，并每10分钟手动摇晃一次。孵育1小时后，将1:1琼脂糖和2×199覆盖层添加到单层上，并将板在37°C、5% CO₂下孵育48小时。48小时后，移除覆盖层，用0.1%结晶紫染色细胞，并计数空斑。

Adoptive plasma transfers

C57BL/6供体小鼠以3周间隔用两剂mRNA-OC43疫苗免疫。最终剂量后7天，通过ELISA确认OC43刺突特异性抗体反应，并汇集免疫小鼠的血浆。这些混合血浆通过腹腔途径过继转移到C57BL/6受体小鼠体内。对照小鼠接受来自幼稚供体的血浆。第二天，所有小鼠腹腔感染2×10⁶ PFU的MHV-A59。感染后第3天，使用TissueRuptor Homogenizer收获组织并匀浆。如上所述，通过空斑试验定量病毒载量。

Antibody treatments for CD4 and CD8 depletion

所有用于体内治疗的抗体均购自BioXCell或Leinco，在无菌PBS中稀释，并通过腹腔注射给药。CD4⁺ T细胞耗竭抗体（GK1.5）和CD8⁺ T细胞耗竭抗体（2.43）以200 μg的剂量每日给药，从感染前1天开始，持续至感染后第3天。所有实验中均包含IgG同种型对照作为对照。

Detection of IFN-γ-producing T cell responses via ELISpot

为了检测产生IFN-γ的抗原特异性T细胞，将96孔ELISpot板用5 μg/mL的抗小鼠IFN-γ单克隆抗体包被，并在4°C下孵育过夜。第二天，用200 μL/孔的无菌1× PBS洗涤板两次，并用200 μL/孔的补充有10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1% Pen/Strep的RPMI培养基在37°C CO₂培养箱中封闭2小时。从脾脏或淋巴结制备2.5×10⁶ cells/mL的单细胞悬液于补充的RPMI中。封闭后，弃去培养基，每孔接种2.5×10⁵个细胞，并使用4 μg/mL的OC43刺突肽池进行刺激。将细胞在37°C CO₂培养箱中孵育18-20小时。来自幼稚小鼠的细胞作为阴性对照。对于阳性对照，细胞用10 ng/mL佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）加500 ng/mL离子霉素（ionomycin），或用抗小鼠CD3和CD28抗体（1 μg/孔）处理。包括等摩尔浓度的DMSO作为阴性对照。未刺激对照包括仅用培养基孵育的细胞。孵育18-20小时后，弃去细胞，用洗涤缓冲液（1× PBS + 0.05% Tween-20）洗涤板五次。然后将板与在PBS加10% FBS中稀释至0.5 μg/mL的生物素化抗IFN-γ抗体孵育90分钟。洗涤后，加入1:1000稀释在10% PBS中的链霉亲和素-碱性磷酸酶，孵育45分钟。用洗涤缓冲液洗涤板，并使用底物显色8分钟。用流水冲洗板终止反应。使用ImmunoSpot Image Analyzer分析斑点形成细胞。在减去阴性对照孔（无抗原）后，计算重复孔的平均值，得出每百万细胞的斑点形成单位数。

Statistical analysis

使用的统计检验在每个图注中指明。数据图中的虚线表示检测限。统计学显著性设定为P值小于或等于0.05，通常通过双尾非配对Student's t检验（Mann-Whitney U检验）进行评估，除非在图注中另有说明。使用Prism version 10分析数据。