基于数字PCR的污水监测新方法：追踪SARS-CoV-2变异株的年度研究及其与临床和GISAID数据的比较

《mSystems》：A 1-year study on SARS-CoV-2 variant shifts in wastewater using dPCR: comparison with clinical and GISAID data

本文推荐一种基于数字PCR（dPCR）的污水基因分型新方法，用于监测SARS-CoV-2变异株。该方法相较于测序（WGS）更具成本效益、快速且易于推广。研究通过对美国六州1,400多份污水样本的分析，证实其检测结果与临床基因分型及全球共享流感数据倡议组织（GISAID）数据高度吻合，并能提供早期预警信号（如EG.5和FL变异株在污水中的检出早于临床22-31天）。该方法与全基因组测序（WGS）的总体一致性在62%-98%之间，展示了其作为临床监测补充工具的巨大潜力，尤其在临床检测下降的背景下，污水监测变得愈发重要。

　　

ABSTRACT

污水检测可用于监测社区中的SARS-CoV-2感染。基于PCR的污水检测数据通常在排泄物和其他体液进入下水道后5-7天内可供公共卫生部门使用。虽然PCR方法可以准确检测和定量SARS-CoV-2，但区分变异株通常需要基于测序的方法，这会延迟结果并增加过程成本。我们开发并评估了一种新颖的、可定制的基于数字PCR（dPCR）的SARS-CoV-2变异株污水检测基因分型方法，该方法比测序更具成本效益、更快速且更易于推广。此方法应用于2023年4月至2024年5月期间从六个州收集的1,400多份污水样本，结果与同期临床数据一起显示在公共仪表板上。基于污水的dPCR方法有效检测了新兴变异株，反映了在临床环境和全球共享流感数据倡议组织（GISAID）平台数据中观察到的趋势；该方法还提供了早期预警信号，例如EG.5和FL等变异株在临床检测之前就在污水中被识别出来。一部分污水样本同时使用dPCR基因分型和测序进行了分析，两种方法之间具有良好的一致性。四种不同变异株的一致性范围在62%至98%之间。这种基于dPCR的污水样本基因分型方法的成功开发和实施证明了其成本效益和可扩展性。随着临床检测的减少，污水监测对于监测SARS-CoV-2变异株和补充临床监测工作变得越来越重要。

INTRODUCTION

SARS-CoV和SARS-CoV-2都是冠状病毒，前者在2002年引起高死亡率疫情，后者则因其快速传播和不断变异的特性引发了一场持久的全球大流行。鉴于其广泛影响，有效的监测策略对于监控和控制未来的疫情至关重要。由于污水检测可用于监测社区中的传染病水平，它已成为一种有效的工具，为疾病预防和控制措施提供信息。基于PCR的方法继续被广泛用于检测和定量污水中的SARS-CoV-2，这些方法的数据通常在排泄物进入下水道后5-7天内可供公共卫生部门使用。随着SARS-CoV-2持续变异，产生具有不同传播力和毒力的变异株，监测这些变异株的出现和丰度已成为污水监测的一个关键方面。尽管是检测和定量的金标准，但基于PCR的方法通常并非设计用于区分广泛的SARS-CoV-2变异株。

美国监测SARS-CoV-2基因谱系的主要方法是对临床和污水样本中的分离株进行基因组测序。实验室测序方法通常复杂、耗时且成本高昂，许多污水检测实验室无法获得测序样本和解读结果所需的仪器或专业知识。

基于PCR的基因分型为快速、经济高效的变异株检测提供了一种潜在的替代方案。通过靶向变异株特异性突变，可以设计PCR检测方法来筛查样本中的这些突变。在这项研究中，我们利用了使用数字PCR（dPCR）系统进行污水检测的增长趋势，开发了一种可定制的基于dPCR的基因分型方法，用于检测污水中的SARS-CoV-2变异株。该方法建立在先前建立的用于临床样本分析的定量PCR（qPCR）方法之上，该方法被证明可提供定量结果，对污水样本中的潜在抑制剂有效，且具有较低的检测限。在这里，我们将这种新方法与一种成熟的污水处理方法相结合，该方法涉及Nanotrap颗粒浓缩，以检测美国六个州污水样本中的SARS-CoV-2变异株。结果被上传到一个公开的仪表板，并与临床qPCR基因分型和全球共享流感数据倡议组织（GISAID）序列基因分型结果一起呈现。

污水处理和dPCR基因分型工作流程包括四个步骤：样本采集、自动化病毒浓缩和核酸提取、dPCR分析，以及基因分型数据分析和可视化。完整的方法细节在材料与方法以及补充材料中提供。开发并部署了多个基于dPCR的基因分型 panel，以匹配研究期间美国SARS-CoV-2变异株流行率的变化。我们将污水dPCR基因分型数据与临床qPCR基因分型数据进行了比较。我们还将dPCR变异株数据与测序数据进行了比较，这些测序数据既来自存入GISAID的序列，也来自一部分样本的污水变异株基因组测序数据。自2020年1月以来，通过GISAID共享的基因组序列一直是SARS-CoV-2病例基因组及相关数据的主要来源。

本文描述了开发、实施和评估这种基于dPCR的方法所面临的挑战和获得的见解，并强调了其作为临床监测补充工具用于社区变异株检测的潜力。本研究突出了基于污水的基因分型作为监测SARS-CoV-2变异株的有效方法的效用。通过整合基于dPCR的基因分型和测序方法，我们比较了污水样本与临床和GISAID数据集中的变异株流行率，证明了强相关性，并强调了污水检测在社区层面追踪变异株的效用。

RESULTS

开发基于dPCR的污水基因分型方法

我们首先使用来自乔治亚州BA.1向BA.2变异株过渡期间（2022年2月至4月）的10份存档核酸样本，证明了在污水样本中进行qPCR基因分型的可行性。结果显示全基因组测序（WGS）和qPCR结果之间存在强相关性，BA.1和BA.2的t检验P值分别为0.9269和0.1983，r值分别为0.6514和0.9922。

接下来，我们将dPCR基因分型应用于乔治亚州在BQ向XBB变异株过渡期间（2023年1月至3月）收集的9份存档样本。结果表明两种方法之间没有显著差异，并且显示出强相关性，BQ.1和XBB的t检验P值分别为0.8342和0.8685，相关系数分别为0.8256和0.8537。基于这些发现，我们为监测BQ.1和XBB变异株的2标记panel制定了标准操作程序，用于测试2023年4月11日至6月19日期间乔治亚州的86份样本。污水基因分型结果与临床数据一致，XBB是被检测到的主要变异株（88.23% vs 96.39%）。

2023年6月，我们更新了变异株panel，增加了XBB、EG、FD和FL的标记，以反映流行率的演变转变。这个更新的panel用于评估2023年6月至9月期间收集的73份存档样本，确认XBB是这一时期乔治亚州最流行的变异株（污水样本中为72.81%，临床样本中为66.47%）。值得注意的是，FL和EG.5变异株在污水样本中的检测分别比临床数据早22天和31天。

最后，在2023年底，随着JN变异株的流行率开始上升，我们验证了一种新的检测方法，用于检测污水样本中的XBB、EG.5、FL和JN，从而能够在2024年初继续进行监测。

污水基因分型结果与临床基因分型和GISAID结果在乔治亚州一年时间框架内相关并互补

使用2023年4月至2024年4月期间乔治亚州的州级数据，我们检查了三种不同方法报告的几种变异株的流行率：污水基因分型、临床样本基因分型和GISAID，这些变异株包括：XBB、BQ、EG.1、EG.5/FL和JN。污水基因分型中XBB的结果追踪了其流行率从2023年4月的近100%稳步下降，直到2024年1月几乎完全消失，这一结果在GISAID数据中得到了反映。临床基因分型数据同样追踪了这一下降趋势，直到2023年10月，当时它完全停止报告XBB。

由于BQ和EG.1变异株在乔治亚州研究期间均以低水平存在，我们将这些结果合并到一张图表中。在研究的大部分时间里，污水基因分型结果与临床基因分型和GISAID结果中报告的这些变异株流行率一致。然而，值得注意的是，污水检测结果显示2023年5月BQ变异株的流行率增加到27%，这在其他两种监测方法中均未报告。

虽然污水基因分型panel 2能够区分EG.5和FL变异株，但在2023年7月至10月期间用于临床样本的基因分型panel无法区分这两种变异株。因此，为了便于在这一时期比较乔治亚州的污水基因分型和临床基因分型，我们将EG.5和FL的流行率合并到一张图表中。污水基因分型结果与临床基因分型和GISAID结果密切吻合。此外，数据表明EG.5/FL在污水样本中的检测比临床样本早22天。

图2D说明了在2023年10月至2024年1月期间，污水样本和GISAID数据集中检测到的BA.2.86/JN变异株的快速上升和占据主导地位。“未知变异株”代表与基因分型panel中已知变异株特异性突变不匹配的SARS-CoV-2信号，可能表明存在新兴变异株。污水中未知标记的上升趋势始于2023年10月，在2024年1月达到约50%的峰值，在2024年2月过渡到带有JN检测的新panel后急剧下降。

污水dPCR基因分型与全基因组测序在变异株检测方面表现出高度一致性

我们使用来自ROSALIND污水仪表板（panel 3）的339个数据点，比较了dPCR基因分型方法与WGS的性能，这些数据来自威斯康星州和伊利诺伊州，那里有相应的测序数据可用。本研究使用的测序方法细节在材料与方法中描述。

威斯康星州卫生实验室卫生处（WSLH）处理了129份污水样本的生物学重复。一份重复使用Nanotrap Microbiome A颗粒进行浓缩，并使用Maxwell HT Environmental TNA试剂盒进行提取，用于Illumina WGS。另一份重复使用Nanotrap Microbiome A颗粒浓缩，并使用MagMAX污水提取试剂盒提取。在伊利诺伊大学，210份污水样本按照dPCR基因分型方案进行处理。这些样本纯化后的SARS-CoV-2 RNA同时使用dPCR和WGS进行了测试。我们评估了通过两种方法处理的339个组合样本的结果。

一致性分析

为了使结果同步，我们将WGS亚谱系汇总到具有共享突变的更广泛谱系中，与dPCR检测panel保持一致。阳性和阴性检测均被考虑在内。两种方法之间的一致性范围从61.9%到98.2%。

相关性分析

对JN、EG.5、XBB和FL变异株的dPCR和WGS结果进行的相关性分析进一步支持了发现之间的一致性，并揭示了两种方法之间不同程度的一致性。对于JN变异株，存在强正相关性（r = 0.7477, P < 0.0001），表明dPCR和WGS之间高度一致。类似地，EG.5变异株表现出统计学上显著的正相关性（r = 0.7067, P < 0.0001），反映了检测结果的强一致性。相比之下，XBB变异株显示出中度正相关性（r = 0.3367, P < 0.0001），突出了方法之间存在相当大的变异性和较低的一致性。对于FL变异株，未观察到显著相关性（r = 0.02055, P = 0.7062），检测频率存在显著差异；WGS仅在3%的样本中识别出FL，而dPCR结果为37%。这些发现强调了两种方法在检测灵敏度、方法学分辨率和基线检测水平方面的差异，特别是对于像XBB和FL这样的重组变异株。

经验教训和改进机会

我们在这个项目中遇到了几个挑战，为未来部署基于dPCR的污水基因分型积累了宝贵的经验，我们已在表2中总结了这些经验。

在国家层面评估污水dPCR基因分型

为了评估在国家层面使用这种dPCR基因分型方法的效用及相关挑战，我们从2023年10月31日开始与多个检测实验室合作。针对XBB、EG.1、EG.5和FL变异株的污水基因分型panel 2由美国各地的五个实验室部署。这些实验室共同测试了来自六个州（加利福尼亚州、乔治亚州、伊利诺伊州、路易斯安那州、纽约州和威斯康星州）的样本，频率约为每个实验室每周17个样本。

在2023年10月31日至2024年5月16日期间，使用dPCR基因分型方法处理和分析了来自这六个州的1,181份样本。在同一时间范围内，使用qPCR基因分型分析了全国范围内的2,323份临床样本中的相同变异株，并且有139,631份临床测序结果存入GISAID。正如在乔治亚州样本的详细分析中观察到的那样，JN.1变异株的出现是在2023年11月初检测到的。该变异株在这六个州的合并污水数据中显示出流行率的快速上升，从2023年12月约9%的2周平均值增加到2024年1月污水样本中约75%的水平。在GISAID数据中也观察到了类似的快速出现模式。

从更广泛的角度来看，这一时期这六个州的污水变异株谱反映了整个国家GISAID数据集中观察到的模式。例如，污水dPCR基因分型数据显示JN标记流行率为57.16%，与GISAID测序数据集中观察到的61.31%密切吻合。请注意，dPCR基因分型BA.2.86/JN检测到的JN标记对应于GISAID数据集中的JN.1、JN.1.1和JN.1.4。此外，GISAID图中的“其他”类别包括27.79%的BA.2.86亚谱系。这导致这一时期GISAID数据集中JN标记的总体流行率为61.31%。这种强一致性凸显了基于dPCR的污水基因分型作为变异株监测的临床和基于测序方法的补充工具的可靠性。

DISCUSSION

在本研究中，我们提出了一种使用dPCR和突变特异性检测方法检测污水中SARS-CoV-2变异株的新方法。先前有几项研究利用突变特异性PCR检测方法检测污水中的SARS-CoV-2关切变异株（VOC）。然而，这些研究主要使用单个突变特异性检测来追踪特定突变，要么是回顾性的，要么是实时的，但没有能力检测社区中传播的新兴变异株。

与这些方法相比，我们的研究采用了针对特异性突变和野生型探针的突变特异性双链检测panel，专为实时污水监测Omicron BA.2亚谱系而设计，提高了检测准确性。此外，我们引入了一种新的流行率计算方法，用于计算在我们检测panel内共享突变的重组变异株，并展示了检测和测量新兴变异株流行率的能力，使该方法对近实时主动监测具有价值。而且，我们的工作流程包括自动化的病毒浓缩和核酸提取过程，提高了效率和可重复性。

尽管污水检测的准确性可能受到特定排水区域特征的影响，但我们在乔治亚州为期一年的研究表明，污水中检测到的变异株流行率与临床样本中的变异株流行率密切匹配，这加强了该方法的可靠性，正如其他研究所报告的那样。对来自乔治亚州的多个数据集的详细分析揭示了几项关键发现。首先，SARS-CoV-2变异株的主导地位和转变，例如2024年初从XBB向BA.2.86/JN的转变，在污水和临床样本中都得到了有效捕捉。我们还注意到，临床基因分型数据追踪了XBB的下降趋势，直到2023年10月，由于基因分型样本数量急剧减少，报告停止了。临床标本数量从2023年8月初的62份减少到9月底的仅2份，并且在2024年2月8日之后，参考实验室没有对任何临床样本进行基因分型。检测数量的下降可能阻碍了qPCR临床结果中流行率的准确评估，但如果有足够的样本，趋势线很可能与GISAID和污水基因分型结果相似。

乔治亚州的数据表明，一些变异株是短暂的，例如BQ和EG.1。2023年5月在污水中检测到的BQ变异株的短暂激增，以及在临床和GISAID数据中没有相应的激增，引发了关于这种差异可能原因的疑问。这可能反映了临床检测的滞后、人群采样的差异，或者该变异株的低致病性，导致尽管广泛传播，但进行标本采集和基因分型的临床病例较少。仅在2023年秋冬的污水数据中检测到EG.1变异株，而在临床或GISAID数据集中没有相应的信号，表明该变异株并未导致显著数量的临床病例。

我们在研究期间观察到“未知/其他”类别有两次显著激增：一次在2023年6月，另一次在10月。这些激增表明病毒持续进化以及新变异株的出现。6月的激增很可能源于FL变异株的引入，该变异株在GISAID数据中有报告，但未被污水基因分型panel检测到，因为当时该panel未包含针对FL的特异性引物和探针。2023年10月，我们怀疑检测到的未知变异株是JN。对2023年12月11日至2024年1月1日期间收集的23份污水样本的存档核酸进行重新测试证实了这一点，因为在部署JN检测后，未知变异株消失了。从2023年10月到2024年4月，未知和JN变异株的同时上升表明污水和GISAID趋势线之间存在强一致性。然而，JN在2023年底的快速上升带来了挑战。我们未能在所有五个检测实验室及时验证和部署该检测方法以实时追踪JN。因此，在2024年1月和2月测试的污水样本中出现了大量未知变异株。检测方法验证后，实验室对保留的RNA样本进行了重新测试，更新后的结果被上传到ROSALIND Tracker。这凸显了需要更频繁的检测方法设计和验证以跟上新兴变异株的步伐。

在威斯康星州和伊利诺伊州进行的dPCR和WGS结果对于JN、EG.5、XBB和FL变异株的一致性研究表明，dPCR基因分型是一种准确可靠的工具，用于监测污水中的变异株。这些发现与先前强调PCR方法具有更高灵敏度和更低样本输入要求的研究一致。然而，我们注意到dPCR和WGS变异株流行率结果之间的一致性程度各不相同。XBB和FL标记较低的一致性可能源于dPCR中单核苷酸多态性检测与WGS中谱系分类协议的差异。诸如XBB这样的重组变异株——由多个谱系形成——可能携带与FL等其他变异株共享的突变。这些突变被dPCR检测到，但它们在WGS中被归类到不同的类别下，导致两种方法之间的差异。类似地，FL变异株检测通常需要多个标记，由于额外的测量和百分比归一化步骤，引入了更大的变异性。相比之下，JN标记显示出更高的一致性，因为存在与其他变异株不共享的独特突变，使得跨方法能够一致地识别。此外，当基因组覆盖率低时，基于测序的基因分型存在一些局限性，因为由于分析的RNA信息不完整，可能会发生变异株识别错误。尽管存在检测灵敏度、变异株命名法和方法学分辨率方面的差异，dPCR基因分型为快速、有针对性的变异株监测提供了一种可靠的方法，补充了WGS更高分辨率的能力。

结论与建议

基于PCR的基因分型为污水中的快速、经济高效的变异株检测提供了一种潜在的测序替代方案。然而，本研究确定了实施基于dPCR的污水基因分型的关键挑战，并提出了改进建议。由于所使用的引物和探针设计工具未针对我们用于测试的dPCR系统进行优化，导致一些引物和探针组在dPCR系统上实施时失败，这可以通过使用制造商推荐的设计工具和定制引物浓度来缓解。单靶标突变dPCR检测被证明效率低下且成本高昂，建议转向多重检测。此外，dPCR仪器制造商的软件更新中断了数据流程，凸显了主动质量控制措施和与制造商协调的重要性。最后，本研究未测量污水中的总体SARS-CoV-2浓度，限制了其在社区传播分析中的效用。未来的工作应包括一个总体SARS-CoV-2靶标以增强监测能力。

尽管存在挑战，dPCR基因分型方法在常规变异株监测方面比WGS具有显著优势，包括更低的成本、更简单和更快的周转时间。截至2024年，单重dPCR将试剂成本降低了36%，样本到结果时间比Illumina测序缩短了68%。dPCR中的多重化可以进一步将试剂成本降低84%，处理时间缩短90%。简化的dPCR工作流程需要更少的步骤和更低的专业知识，并且允许快速更新标记物而无需大量重新验证，使其成为追踪不断演变的变异株的理想选择。虽然WGS提供了更高的精度并能检测重组体，但dPCR是进行持续高通量SARS-CoV-2污水监测的一个实用、经济高效的选择。然而，与WGS不同，基于PCR的基因分型无法识别新突变或提供全面的基因组信息，使其不太适合探索性监测。与qPCR相比，dPCR具有高灵敏度、准确性和对抑制剂的耐受性，但运行时间更长，并且由于多重化的成本和复杂性，可能不太适合高通量格式下的多靶标检测。

我们在乔治亚州为期一年的研究中观察到，每个季度总有一个变异株的流行率持续超过50%，并且在任何给定时间主导谱系的变异株不超过三个。这表明，对于社区层面的监测项目，像基于dPCR的基因分型这样的广泛检测工具可以提供足够的分辨率来监测病毒变异株的主要转变，并且可能足以理解临床结果。在这种情况下，像WGS这样的高分辨率方法（检测亚谱系）可能并不总是必要的。此外，这些发现强调需要定期开发和验证多重污水panel，以有效捕捉持续演变的变异株景观。在研究期间，我们还观察到未知变异株在不同时间点的存在和突然增加。为未知标记建立检测阈值并监测其增加速率，可以作为触发新检测方法开发和验证工作的指标。快速识别新兴变异株的能力对于及时的公共卫生干预至关重要。

我们比较了代表美国东北部、南部、中西部和西部地区的六个州的污水基因分型结果，与临床qPCR基因分型数据和GISAID中的测序结果进行了对比。尽管与全国数据相比区域覆盖范围较小，并且与临床数据集相比污水数据集样本量较小，但比较显示了相似的趋势和变异株谱。这种强一致性强调了基于dPCR的污水基因分型作为临床标本检测和基于测序的SARS-CoV-2变异株监测方法的补充工具的可靠性。

总体而言，我们的研究结果支持使用基于污水的SARS-CoV-2基因分型作为一种经济有效且对临床样本基因分型和测序的补充方法，提供了更广泛、更全面的变异株流行率和传播情况。这种方法在临床检测有限时期尤其有价值，正如研究期间所观察到的那样。除了SARS-CoV-2，本研究中描述的基于dPCR的基因分型平台有望用于追踪污水中的其他病原体。其高灵敏度和特异性使其特别适用于监测低丰度靶标，例如其他呼吸道病毒（如流感和呼吸道合胞病毒RSV）的新兴变异株、抗生素耐药性基因或肠道病原体如诺如病毒和沙门氏菌。随着公共卫生机构扩大对污水监测的使用，dPCR可以作为一个灵活且可扩展的工具，用于早期检测和人群水平监测广泛的传染病。

MATERIALS AND METHODS

污水收集

我们从2023年4月到2024年5月，在六个州处理和分析了1,416份污水样本。表3列出了从每个州测试的样本数量以及这些州的收集期。

污水样本是从多种来源收集的，包括污水处理厂和惩教设施，作为五个测试实验室常规污水测试的一部分。使用主要是自动复合采样方法从美国六个州的91个地点收集污水样本。大多数地点采用污水处理厂进水口的24小时时间或流量加权复合采样。加利福尼亚州的地点收集出水样本，伊利诺伊州的一个地点提供瞬时样本。采样频率从每周一次到两次不等，每个地点收集的体积从40毫升到500毫升不等。环境监测数据，包括样本到达温度、总流量，以及可选的pH、溶解氧和电导率，在可用的情况下被记录——最全面的是在威斯康星州和伊利诺伊州。按州划分的完整采样规范，包括地点类型、方法和环境参数，在补充表S8中提供。

在六个参与州中，大多数污水样本在到达后立即处理，或在分析前在适当条件下储存以保持样本完整性。当处理延迟发生时，通常是由于物流因素，如样本运输时间表或用于高效实验室工作流程的批次策略。

污水处理

使用Nanotrap Microbiome A颗粒和增强试剂1（ER1）在Thermo Scientific KingFisher Apex系统上实现自动化SARS-CoV-2浓缩。简而言之，将75 μL Nanotrap Microbiome A颗粒和50 μ