肠道菌群代谢功能群：不同结构菊粉特异性代谢特征与健康关联的新见解

《mSystems》：Xenometabolomics reveals metabolic functional guilds unique to specific inulin subtypes in human gut microbiota cultures

本研究通过体外发酵模型揭示，不同聚合度（DP）和分支结构的菊粉（inulin）可引导人类肠道菌群形成独特的代谢功能群（metabolic functional guilds），产生特异性的异源代谢物（xenometabolites）谱。这一发现超越了传统短链脂肪酸（SCFAs）的视角，为解释膳食纤维普适性健康益处提供了新的机制框架。

　　

ABSTRACT

膳食纤维对健康的促进作用通常归因于大肠细菌发酵及其相关的生物活性代谢物。历史上，后者的研究主要集中在短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸盐。胃肠道微生物群产生数千种异源代谢物（微生物衍生的“非宿主”代谢物）。其中大多数在组成和潜在生物活性方面仍未得到表征，并且关于纤维结构对异源代谢组（xenometabolome）的影响知之甚少。本研究利用液相色谱-质谱联用（LC/MS）技术，对源自三名健康成年捐赠者粪便的传代培养物上清液代谢物谱进行了表征，这些培养物使用了六种覆盖不同聚合度（DP）范围的菊粉。在最终数据分析包含的1,219个LC/MS检测到的代谢物中，704个代谢物的浓度具有统计学显著性。其中仅有15个代谢物具有结构注释，这凸显了与菊粉底物相关的大量“未知”异源代谢物的存在。尽管不同捐赠者内部的微生物群落结构存在高度差异，但每种纤维类型都导致了独特的代谢物特征。这说明尽管人类肠道细菌群落高度多样化，但纤维特异性的代谢功能群依然会显现。这些代谢功能群可能有助于解释为何尽管肠道微生物群模式高度不同，但膳食纤维的健康效应在人群中普遍存在。结果也进一步证实，纤维结构对异源代谢组具有深远影响。

INTRODUCTION

饮食模式、特定食物和膳食补充剂与健康结局和生理调节相关，而肠道微生物群参与了这种饮食-健康关联。特定肠道微生物群落的流行模式通常与宿主健康或生理功能相关或存在关联。粪便/盲肠内容物转移研究最有力地说明了特定细菌或细菌群影响生理功能。尽管具体作用机制尚未完全阐明，但肠道微生物代谢产生的分子（以下简称异源代谢物）可以调节宿主系统，也可以作为微生物-微生物信号，改变微生物群落的功能和系统发育多样性。

人类胃肠道（GI）栖息着区域性的庞大微生物群（无论是数量还是生物量），具有巨大的基因组和代谢潜力，这些微生物每天暴露于来自外源（如食物、膳食补充剂、药物和环境分子）、宿主（如初级胆汁酸、尿素）及其同类微生物的无数分子。这些因素之间潜在的相互作用强调了胃肠道中存在巨大的酶促和非酶促从头异源代谢物生产以及共代谢物（源自宿主和微生物共同作用的分子）产生的容量。代谢组学方法捕捉到了这种代谢景观。

微生物附着、降解和代谢饮食中复杂底物（尤其是多糖）的能力各不相同。天然多糖中碳水化合物连接键的多样性需要多种酶——有时由多个物种编码——才能完全水解。因此，即使纤维结构的细微差异也可能导致不同的代谢结果。因此，它们各自可能对健康产生独特的影响。

本研究测试了以下假设：仅两个结构参数（链长和分支）不同的纤维将影响其微生物加工和微生物代谢，使用菊粉作为具有相对简单结构范围的模型纤维类别。菊粉是植物碳水化合物储存聚合物，通常作为膳食纤维添加到食品中。作为益生元，菊粉已知可以改善钙吸收和肠道功能，增加饱腹感并调节餐后血糖反应，并在低至5克/天的剂量下减少炎症标志物。这些益处被认为是由微生物发酵和代谢物（主要是短链脂肪酸）的产生所介导的。然而，比较不同链长菊粉的少数研究揭示了生理结局的差异，表明不同的菊粉可以驱动不同的微生物衍生的生物活性终产物。

MATERIALS AND METHODS

本研究使用了六种菊粉样品，包括一种从Alfa Aesar购买的和五种由Sensus提供的样品。通过尺寸排阻色谱（SEC）对菊粉样品进行分级分离，以去除小于DP2的分子。使用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）测定SEC分级分离后菊粉样品的分子谱。使用部分甲基化醛醇乙酸酯方法测定六种菊粉样品的连接类型。

人类粪便样本收集自三名成年捐赠者。将粪便样本在化学定义的肠道矿物质培养基中匀浆，用作连续传代发酵的接种物。菊粉作为唯一的碳水化合物碳源提供。连续传代进行七天，传代间隔为24小时。每天记录气体超压、培养基pH值，并收集上清液和细胞沉淀用于后续分析。

使用16S rRNA基因测序进行群落分析。基因组DNA从细胞沉淀中提取，针对16S rRNA基因的V4-V5区域进行扩增子测序。使用mothur软件处理测序数据。

使用气相色谱（GC）分析培养上清液中的短链脂肪酸（SCFAs）含量。使用LC/MS进行非靶向代谢组学分析。培养上清液用甲醇和乙腈沉淀蛋白，干燥后复溶进样。使用Compound Discoverer软件处理原始数据，进行代谢物鉴定和统计分析。

RESULTS

Inulin fermentation metabolic outputs were highly variable across donors’ microbiota, inulin structures, and lineages

离子色谱确认菊粉平均链长（聚合度，DP）依次增加：Frutalose L90 (L90; DP ~ 3) < Alfa Aesar (AA; DP ~ 5) < Frutafit CLR (CLR; DP ~ 8) < Frutafit IQ (IQ; DP ~ 12) < Frutafit TEX (TEX; DP > 23)。连接分析数据进一步支持这些菊粉链长结果。仅在Frutafit agave inulin (AGA)中检测到与分支相关的连接。

不同捐赠者的粪便群落在其菊粉代谢方面存在显著差异。测量了每次24小时传代后的最终酸度和气体产量。不同捐赠者-菊粉配对的最终pH和气体测量值存在显著差异。这些数据表明：（1）捐赠者微生物群的独特初始组成导致了对菊粉不同的初始发酵动力学和输出；（2）菊粉发酵揭示了酸和气体生产之间的权衡。

初始微生物组组成与菊粉结构相互作用影响短链脂肪酸（SCFAs）的产生。对于捐赠者1的微生物群，第一次传代24小时后乙酸盐的产生大致与菊粉链长成反比。相反，捐赠者2的微生物群发酵TEX产生显著更高的乙酸盐和丙酸盐，但丁酸盐显著降低。与两者相比，捐赠者3的微生物群将所有菊粉结构发酵成几乎等量的乙酸盐，但丙酸盐（TEX最低）和丁酸盐（TEX最高）表现出显著变异性。这些数据表明，菊粉结构对SCFA代谢的影响最初在很大程度上取决于捐赠者微生物群的差异，连同酸-气体生产数据暗示，不同的粪便微生物群群落最初将菊粉代谢为不同的终端发酵产物。

Observations of metabolically compromised lineages and definition of viable lineages for microbiome and metabolome analyses

随着培养物在七天的传代过程中被连续稀释，所有捐赠者微生物群和菊粉结构的SCFA产量均下降，同时气体产量减少，最终pH值升高，但方式因菊粉结构和谱系而异。一些谱系维持了强劲的代谢输出三或四次传代，但在第四次或第五次传代时似乎变得代谢失活且未能恢复。重要的是，这个过程似乎是随机的。为了解释这种效应，我们将一个群落的代谢衰竭定义为在最终传代中满足pH ≥6.5、气体产量≤1.0 mL和乙酸盐≤5 mM的条件；满足所有这些条件的培养物被确定为失败谱系。

有趣的是，失败谱系伴随着多样性的几乎完全崩溃，并且通常被来自单个细菌操作分类单元（OTU）的DNA所主导。由于演变成OTU2近纯培养物的谱系与谱系失败和不可恢复密切相关，我们增加了一个分类学标准：单一OTU相对丰度超过95%的谱系被归类为失败谱系，作为谱系失败的第二个独立标准。根据上述标准，代谢失败的谱系被排除在培养第7天代谢组学模式的分析之外。

Community assembly on inulin structures was stochastic across inulin structures and lineages

与之前在阿拉伯木聚糖和AA菊粉上观察到的更为确定性的演替不同，在不同菊粉结构上的演替在不同谱系之间表现出随机性。发酵微生物群落组成使用16S扩增子测序进行测量，取决于捐赠者的微生物组组成和底物类型。尽管微生物相对丰度在捐赠者1和捐赠者2接种物的第一次传代中没有显著改变，但在捐赠者3群落中，所有菊粉类型下的^{Prevotella copri} (OTU 7)丰度在第一次传代时均增加。

菊粉结构并未一致地影响群落演替过程中的物种丰富度（观察到的物种数）；然而，在某些情况下，α多样性的均匀度参数受到结构的调节。正如预期的那样，在所有处理和谱系中，观察到的物种数量通过连续传代而减少，平均均匀度值在所有捐赠者和处理中在第1或第2次传代时触底。发酵AGA的群落比发酵菊苣菊粉的群落具有更高的平均均匀度，这可能归因于AGA的分支结构与线性菊苣菊粉结构相比。使用Bray-Curtis相异度量化β多样性；初始捐赠者微生物组组成对最终群落组成的影响很强，驱动了捐赠者特异性的聚类。

Inulin-associated metabolomics patterns

对于每个代谢物，首先测试了比较不同菊粉类型时其浓度（半定量定量离子峰面积）是否显示出统计学显著差异。在最终数据分析包含的1,219个代谢物中，704个代谢物的浓度具有统计学显著性。其中，只有15个代谢物具有结构注释。这表明人类粪便来源细菌的特定代谢输出受到生长培养基中提供的菊粉类型/结构的强烈影响；然而，这些代谢物中的大多数结构未知。

进一步的^{post hoc}分析表征了菊粉亚组和单个菊粉之间的成对差异。有5个注释（已知）代谢物和224个未注释代谢物在至少一个对比中显示出菊粉类型的浓度差异，FDR < 0.05。一些代谢物仅存在于单一菊粉类型中；其他代谢物存在于某些菊粉条件下，但在其他条件下缺失；许多代谢物在多种菊粉中发现，但浓度不同。

为了进一步定义菊粉特异性的代谢物变异，对上述229个在^{post hoc}对比中FDR < 0.05显示显著差异的代谢物进行了主成分分析（PCA）。成分1解释了>38%的变异，并在视觉上表明这些代谢物可以轻易地将AGA来源的菊粉处理样品与所有菊苣来源的菊粉区分开来。为了细化考虑独特AGA相关模式的菊粉类型区分代谢物，生成了没有AGA数据的第二个PCA。后者（即仅菊苣菊粉）PCA使用148个代谢物进行，显示了四个独立的簇，清楚地定义了前两个成分上的TEX/IQ、AA、CLR和L90处理，解释了数据中46%的变异。这些PCA的解释通过可视化描绘所有菊粉、捐赠者和谱系中229个代谢物缩放丰度的热图结果得到加强。热图结果表明AGA代谢物模式与其他处理不同，与PCA结果相似。与没有AGA样品的PCA一致，热图结果显示L90处理导致了独特的代谢物特征；TEX和IQ似乎更相似，AA是独特的，而CLR模式与AA和TEX/IQ共享一些特征。

Associations between stool bacteria cultures and metabolite patterns

一个值得注意的观察是，尽管不同捐赠者和谱系之间的细菌群落结构不同，但与特定菊粉相关的代谢物谱是独特的。这表明菊粉类型相关的代谢物模式是由代谢功能群产生的，而不是仅仅依赖于特定的微生物分类群。

为了更详细地评估这个想法，进行了一项详尽的分析，以确定所有最初用于统计分析的1,219个代谢物与在谱系中表征的优势细菌OTU之间的相关性。尽管在某些情况下存在统计学上显著的Spearman等级相关系数，但许多相关性在视觉检查下并不稳健。解释相关性时必须考虑到涉及如此大量代谢物和OTU的相关分析中可能出现I型统计错误的风险。也就是说，我们确实观察到对于OTU1 (^{Bifidobacterium} sp.)，存在几个与未注释代谢物显著正相关，这些相关性在一系列OTU丰度值上似乎呈现线性关系。总之，在特定OTU和特定代谢物之间只有非常有限数量的稳健相关性，这进一步支持了代谢功能群驱动观察到的纤维特异性代谢物特征的概念。

DISCUSSION

流行病学研究一致表明，充足的膳食纤维摄入与积极的健康结局和降低多种疾病风险相关。基于这项工作以及低纤维摄入与较高心血管疾病风险之间的关系，2020-2025年美国人膳食指南将纤维视为公众关注的营养素，并建议摄入量至少为14克/千卡，成人最高可达30+克/天，具体取决于年龄、性别和每日卡路里需求等因素。不太明确的是应消耗的纤维类型和纤维特异性的作用机制。后者的讨论通常集中在促进特定肠道微生物（例如双歧杆菌、乳酸杆菌）的生长以及纤维作为细菌产生异源代谢物（如短链脂肪酸）的底物。

尽管有大量关于SCFAs和几种其他已知影响宿主生理的异源代谢物的文献，但需要对反映微生物代谢能力和复杂生物化学的数千种代谢物进行更全面的探索，以及代谢如何响应不同纤维类型。关于后者，天然食物纤维、作为补充剂提供的纤维和作为食品成分添加的纤维在结构上可能差异显著；后者可能会影响微生物对纤维代谢的性质。在此，我们利用非靶向代谢组学平台分析了用结构多样性菊粉培养的人类粪便来源细菌培养物。研究揭示了新颖的菊粉类型特异性代谢物特征，并在 otherwise 复杂且高度可变的细菌群落中发现了纤维特异性代谢功能群的显著证据。

考虑到菊粉底物可被许多微生物物种广泛发酵，我们预期与我们在更复杂多糖上观察到的更为确定性的演替相比，随着时间的推移（传代）会出现稳定（即使相对随机）的群落演替。相反，我们观察到在菊粉上生长的培养物中群落组装和稳定性出乎意料地不一致。此外，一些谱系在多样性和代谢输出（通常两者兼有）上发生退化，表明尽管接种到新鲜培养基中，代谢性能仍显著降低。我们观察到，在任何特定的菊粉处理中，细菌群落组成、稳定性和整体代谢性能都依赖于捐赠者。观察上，这些结果在提供较长链菊粉（IQ, TEX）的培养物中更为一致，除了用捐赠者2微生物群接种的培养物。每个谱系中双歧杆菌种群的大小与群落的代谢性能高度相关；在观察到大量双歧杆菌种群的地方，失败谱系很少见。

这些实验中最显著的发现是，尽管不同捐赠者之间的群落结构高度可变，但存在跨捐赠者谱系共享的菊粉特异性代谢物模式。尽管我们最初预期菊粉链长会选择不同的生物体，从而产生不同的代谢物模式，但我们反而发现了更强的证据，表明特定的纤维驱动独特的代谢特征，尽管跨捐赠者的微生物群落结构高度多样化。这与表明保守宏基因组的数据一致，特别是在降解简单纤维（如菊粉）的机制方面，并突出了代谢功能群的存在，其中当暴露于特定纤维类型时，相似的生化机制在不同分类群中发挥作用。从这个意义上说，代谢功能群可以定义为一组在代谢方面具有共享功能特性的系统发育不同的生物体。行会（guild）的概念对于微生物生态学来说绝非新鲜事物；然而，这一原则往往应用于非常笼统的层面（例如，“产甲烷菌”、“硫酸盐还原菌”、“好氧异养菌”）。Wu等人强调了将行会概念应用于宿主表型、肠道微生物群群落和宏基因组之间关联时的潜在重要性。在此，我们将这一概念扩展到肠道微生物代谢功能群，表现为纤维特异性代谢物特征。也许支持这一概念的最有力证据是，在比较单个细菌物种（OTUs）与单个代谢物时，观察到非常少具有统计学显著性且合理可靠的相关性。众所周知，根据肠型、饮食和其他因素，一个人的胃肠道可能栖息着产生特定代谢物的不同丰度的微生物：例如，丁酸盐生产者、乳酸菌或产甲烷菌。最近，有人考虑了琥珀酸型（存在琥珀酸代谢的肠道来源细菌）的概念。然而，通过探究数百种代谢物，当前结果说明了一个功能性代谢行会如何以多种代谢途径的变化为标志，远远超出单一代谢物或代谢物类别，并且存在取决于菊粉类型的主要异源代谢物模式。这些模式的出现可能部分源于生物物理和生化影响的差异。例如，尽管不同链长的菊粉在糖基残基组成上非常相似，但进入细胞的速率和导入寡糖的平均大小可能随链长而有很大差异（即，较长链可能意味着通量较慢和寡糖较大，因为它们的利用部分依赖于细胞外酶的水解）。

尽管需要更多的研究来了解哪些代谢物调节宿主生理和微生物-微生物串扰，但这些发现支持了特定纤维与健康之间的关联源于大量生物活性代谢物的概念，这些代谢物在很大程度上由纤维结构驱动。一个有趣的延伸是观察到菊粉和果寡糖通常在体外促进“有益”的双歧杆菌和乳酸杆菌，但在人体喂养试验中观察到这些微生物群的扩增并不一致。我们提出，尽管代谢特定纤维的肠道微生物群落结构存在变异性，但在大多数人中可能会产生协调的纤维特异性异源代谢组谱。这一假设需要在对照喂养试验中进行检验，该试验探究不同人群中胃肠道异源代谢组的纤维相关变化。在这一纤维类型依赖性差异代谢领域的进一步知识可能对细化特定纤维建议的膳食指南、益生元和益生菌的协同作用以及个性化营养策略的设计产生深远影响。

历史上，大多数关于膳食纤维和肠道微生物代谢的讨论都集中在短链脂肪酸（尤其是丁酸盐）产量的增加上。最近的报告强调，提供如菊粉等纤维可以改变数百甚至数千种异源代谢物。例如，当前结果和现有文献支持以下假设：膳食纤维（包括菊粉）的生理效应源于细菌在^{in situ}产生多种代谢物。纤维相关的生物活性异源代谢物的完整清单仍有待发现，但追求这些知识对于揭示膳食纤维健康效应背后的机制至关重要。

总之，我们的研究揭示，即使是不相似的微生物群落结构也拥有代谢不同菊粉的功能冗余性——此处指链长不同——以在纤维类型内产生相似的代谢结果。结果表明（i）尽管碳水化合物连接结构 otherwise 相似，但纤维发酵的代谢结果对聚合度的微小差异非常敏感，以及（ii）纤维类型相关的代谢物特征可能源于源自人类肠道的微生物群中代谢功能群的存在。通过利用粪便培养物，我们能够令人信服地证明这些纤维型异源代谢物模式源于细菌代谢，而不是与宿主或肠道管腔环境的相互作用。我们承认我们的研究条件经过优化，以在确定的环境中识别纤维衍生代谢物，而个体间宿主过程（例如，饮食、营养和代谢物吸收、疾病状态）或物理化学参数（例如，pH、氧化还原状态）的^{in vivo}差异可能会显著改变纤维-微生物群-异源代谢物模式的关联。此外，^{in vivo}纤维发酵发生在密集且多样的结肠群落中，而不是经过连续传代选择的群落中，这可能会改变本研究中在粪便接种物中观察到的链长与代谢结果之间的关系。我们研究的另一个潜在局限性是，采用高度保守的代谢物过滤方法来获得用于统计建模的最终变量集，这可能降低了我们检测全套菊粉特异性代谢物的能力。尽管存在这些解释上的注意事项，我们的结果支持以下概念：人类肠道来源微生物的分类学多样性代谢功能群响应于结构多样性纤维产生共享的代谢物谱。代谢功能群的性质有待在健康和患病人类的不同群体中，通过评估摄入特定菊粉和其他纤维后粪便和生物区域异源代谢组来进一步阐述。