酶法诱导辅色化提升石榴汁浓缩物贮藏期间色泽稳定性研究

《Applied Food Research》：ENZIMATICALLY INDUCED COPIGMENTATION IN POMEGRANATE JUICE CONCENTRATE DURING STORAGE

本研究针对石榴汁浓缩物(PJC)贮藏期间花色苷降解和色泽不稳定的问题，通过酶法诱导辅色化技术，探究了单宁酰基水解酶(TAH)联合对氧磷酶-1(PON-1)处理对PJC色泽的增强作用。结果表明，“TAH+PON-1”处理能有效诱导辅色化，显著提高颜色密度和超色效应，且在4°C贮藏下花色苷稳定性提升达5倍。该研究为果汁工业提供了一种经济可行的色泽稳定化解决方案。

　　

石榴是一种采收期集中（10-12月）的水果，为了全年利用其健康益处，采收后立即生产的石榴汁（PJ）需要被浓缩成石榴汁浓缩物（PJC）进行贮藏。PJC不仅用于复配石榴汁，还广泛应用于石榴酱等传统产品，甚至作为烘焙产品的着色剂。因此，提高PJC在全年贮藏期间的色泽稳定性，对于保证众多石榴制品的高品质至关重要。

然而，PJ和PJC生产商面临的最棘手问题，便是其诱人的红色在贮藏过程中容易发生降解和褪色。以往研究探索过诸如冷冻浓缩和渗透浓缩等方法来保护PJ及其制品的生物活性成分并提高色泽稳定性，但这些方法需要高昂的额外投资成本，难以被果汁产业迅速采纳和应用。相比之下，辅色化技术因其经济可行且操作简便，成为稳定PJC色泽最具吸引力的选择。

在天然生理条件下，花色苷通过与多酚、蛋白质、氨基酸、金属离子等多种物质发生辅色化作用，从而保持长期的颜色稳定性和鲜艳度。辅色化被认为是保护花色苷免受有害环境因素影响的有效方法，其原理在于花色苷（特别是醌型碱和花烊盐离子）与无色辅色素之间的非共价和共价相互作用。除了能提高花色苷的稳定性，辅色化还能丰富其显色效果。

以往的研究多侧重于向澄清的石榴汁中添加外部辅色素，如某些酚类物质（没食子酸、阿魏酸、咖啡酸）、氨基酸（苯丙氨酸、天冬氨酸、缬氨酸）以及亲水胶体（白蛋白、酪蛋白、壳聚糖、黄原胶）等。但这种方法不仅会增加成本，还可能引起产品产生沉淀和浑浊等质量问题。因此，开发不依赖外加辅色素的色泽提升方法显得尤为重要。

本研究基于作者团队先前开发并已在欧洲专利局注册的酶法澄清技术，首次系统研究了该技术对PJC中花色苷稳定性、颜色值以及辅色化现象的影响。研究的核心目标是，仅通过为澄清目的而添加的酶所产生的水解产物来引发辅色化，从而提升或维持PJC的颜色值，而不添加任何外部辅色素。这项研究开创性地提出了在PJC中实现酶法诱导辅色化的新策略，该方法易于被PJ和/或PJC生产商实施，有望解决生产和贮藏过程中常见的色泽损失和降解难题。

本研究主要运用了几项关键技术方法。首先，使用来自土耳其梅尔辛的Hicaznar品种石榴，经清洗、去蒂、切块和压榨后获得原汁。其次，对石榴汁进行酶法处理，核心处理组为“TAH (1 g/L) + PON-1 (0.33 mg/L)”，在30°C下反应90分钟，之后通过加热（90°C, 2分钟）灭酶。然后，将处理后的果汁和未处理的对照组果汁均在40°C下真空旋转蒸发浓缩至69 °Bx。最后，将浓缩汁分别在4°C和20°C下贮藏，并系统监测其理化指标变化。分析检测方法包括：采用pH示差法测定总单体花色苷含量（TMAC）；通过测定最大吸收波长处的吸光度变化（ΔA_max）评估超色效应（Hyperchromic effect）；参照Giusti & Wrolstad的方法测定颜色密度（Colour density）和聚合色百分比（Percent polymeric colour）；利用高效液相色谱（HPLC）分析技术，分别采用特定的C18色谱柱和梯度洗脱程序，详细测定了样品中的个体花色苷、酚类物质（如没食子酸、绿原酸、表儿茶素、鞣花酸、α-安石榴苷、β-安石榴苷、芦丁）和氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸）的组成和含量；同时，也对样品中的蛋白质（如白蛋白、醇溶谷蛋白）进行了定量分析。所有统计分析均使用Minitab软件完成，以评估不同处理、贮藏温度和时间对各项指标的显著性影响。

3.1. 贮藏期间花色苷含量和颜色变化

研究分析了PJC在4°C和20°C贮藏期间单体花色苷含量、超色效应、颜色密度和聚合色的变化。贮藏开始时，对照组单体花色苷含量为611 mg/L。经“TAH”处理的样品其花色苷含量与对照组无显著差异（p > 0.05），而“TAH+PON-1”和“TAH+PON-1+P”处理组的含量则降低了约5%（p < 0.05）。值得注意的是，尽管“TAH+PON-1+P”处理组的单体花色苷和聚合色值与“TAH+PON-1”组相近，但其颜色密度却显著更低，表明“P”的活性产物降低了颜色密度，而“PON-1”的活性产物则增加了颜色密度。最重要的是，“TAH+PON-1”处理组在整个贮藏期间（无论是贮藏前还是贮藏后）都表现出最高的超色效应，这表明该处理成功诱导了辅色化。在20°C贮藏下，“TAH+PON-1”处理还显示出最高的超色效应稳定性。在4°C贮藏条件下，“TAH+PON-1”和“TAH+PON-1+P”处理组在贮藏结束后表现出比对照组高10%的颜色密度和8%的超色效应。与20°C相比，4°C贮藏能显著提高所有样品中个体花色苷（稳定性提升高达5倍）、超色效应（高达13倍）和颜色密度（高达2倍）的稳定性。综合来看，推荐采用“TAH+PON-1”处理并结合4°C贮藏，以获得色泽更佳、更稳定的PJC。

3.2. 贮藏期间花色苷谱的变化

PJC中检测到的主要花色苷包括氰啶-3-葡萄糖苷（cy-3-glu）、氰啶-3,5-二葡萄糖苷（cy-3,5-diglu）、天竺葵素-3-葡萄糖苷（pg-3-glu）、飞燕草素-3,5-二葡萄糖苷（dp-3,5-diglu）、飞燕草素-3-葡萄糖苷（dp-3-glu）和天竺葵素-3,5-二葡萄糖苷（pg-3,5-diglu）。研究发现，“TAH+PON-1”处理导致除pg-3,5-diglu外的所有花色苷含量显著下降（6.4–13.8%），这被归因于这些花色苷参与了由鞣花单宁和没食子单宁降解产物介导的辅色化反应。相关性分析进一步证实，在去除“TAH+PON-1+P”处理组的数据后，个体花色苷含量与超色效应值之间存在高度相关性，说明“TAH+PON-1”处理有效促进了辅色化的发生。

3.3. 氨基酸、蛋白质和酚类对辅色化形成的影响

3.3.1. 氨基酸的影响

PJC中检测到天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸等氨基酸。酶处理普遍提高了氨基酸含量。相关性分析表明，在对照组中，谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸与多种花色苷的变化显著相关，且这些氨基酸的变化与超色效应值高度相关，证实了它们参与辅色化。特别是在“TAH+PON-1”处理组中，天冬氨酸与花色苷的相互作用尤为突出，其带来的辅色化稳定性甚至优于外源添加天冬氨酸的效果，稳定性提高了27%。这表明酶解释放的内源性天冬氨酸是高效的辅色素。

3.3.2. 蛋白质的影响

研究发现PJC中含有白蛋白和醇溶谷蛋白。贮藏结束后，醇溶谷蛋白与所有花色苷（尤其是cy-3,5-diglu和dp-3,5-diglu）均显示出高度的正相关性，表明白蛋白和醇溶谷蛋白，特别是后者，在贮藏后期对花色苷具有显著的辅色化作用。这种相互作用可能涉及疏水作用、氢键或甚至共价结合。

3.3.3. 酚类的影响

PJC中主要的酚类物质包括α-安石榴苷、β-安石榴苷、没食子酸、鞣花酸、绿原酸和芦丁。芦丁与所有花色苷在贮藏期间均呈现显著正相关，且与超色效应值高度相关，表明芦丁是PJC中关键的酚类辅色素。其大分子结构和丰富的π电子体系有利于与花色苷发生π-π堆积，从而稳定花色苷的烊盐离子。此外，在“TAH+PON-1”处理组中，没食子酸（TAH水解没食子单宁的产物）和α-安石榴苷含量的变化也与花色苷含量及超色效应显著相关，表明这些酚类物质及其水解产物也积极参与了辅色化过程。

本研究得出结论，“TAH+PON-1”处理能最有效地诱导PJC产生辅色化，显著提高其颜色密度和超色效应。辅色化主要涉及dp-3-glu和pg-3,5-diglu等花色苷，以及没食子酸、天冬氨酸、芦丁和醇溶谷蛋白等内源性物质。若计划用PJC来生产PJ，强烈推荐采用“TAH+PON-1”处理以获得更佳色泽。贮藏温度至关重要，4°C贮藏能极大提升花色苷稳定性、超色效应和颜色密度的保持率。综上所述，在PJ澄清环节使用“TAH (1 g/L) + PON-1 (0.33 mg/L)”于30°C处理90分钟，随后浓缩并在4°C下贮藏，是生产高色泽品质和稳定性的PJC及PJ的理想工艺。本研究首次提出的酶法诱导辅色化策略，其稳定效果优于外源添加辅色素的方法，为果汁工业解决色泽难题提供了一种创新、经济且易于实施的解决方案，具有重要的理论和实践意义。