FlowMagic?新型细胞分离装置：显著降低PBMC分离中红细胞和粒细胞污染的新策略

《PLOS One》：Development of a new cell isolation device FlowMagicTM

本刊编辑推荐：本研究开发了一种新型细胞分离装置FlowMagic?，通过专利双层插入结构有效解决外周血单个核细胞（PBMC）分离过程中的红细胞（RBC）和粒细胞（GRA）污染问题。实验证明，该装置在血液采集后72小时内仍能保持RBC污染低于检测限（Q50=0.0），并显著提升CD3+、CD4+等免疫细胞回收率，为临床检验和细胞治疗提供了更可靠的技术方案。

　　

引言

外周血单个核细胞（PBMC）的分离是实验室检测、临床试验和基础科学研究中的关键预处理步骤，广泛应用于酶联免疫斑点（ELISPOT）检测、增殖试验、流式细胞术和飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）等检测方法。在这些检测中，分离的细胞应具有高活性，且基本无红细胞（RBC）、粒细胞（GRA）和血小板污染。

PBMC主要通过密度梯度离心法分离。尽管标准方法是Ficoll-Paque梯度离心，但近年来其他PBMC分离装置因流程更快速、简便而商业化。这些装置具有更短的离心时间（带刹车），比Ficoll-Paque技术更高效。BD Vacutacher细胞制备管（CPT）是一种含有抗凝剂和细胞分离介质（包含聚酯凝胶和密度梯度液）的真空管。Greiner Bio-One LeucoSep管具有多孔膜滤片，可将密度梯度与全血样本隔离。此外，作为第二代细胞分离装置，STEMCELL Technology的SepMate管含有一个插入件，在密度梯度介质和血液之间形成屏障，从而无需小心铺层血液，并可通过简单倾倒轻松收集单个核细胞。

尽管有许多提高PBMC分离便利性的技术和方法，但这些方法仍受到低水平RBC污染的困扰。此外，当大规模分离PBMC时（如大多数体外过继免疫疗法），污染RBC的量会进一步增加。PBMC样本中存在的RBC污染可能导致PBMC浓度测量不准确，从而对下游实验产生不利影响。为解决这一问题，可采用RBC裂解方案减少RBC污染，但这些额外步骤繁琐、耗时，并可能引入人为误差。

粒细胞（GRA）也是PBMC处理过程中的主要污染源。GRA通常与RBC一起沉淀。然而，由于运输或设施限制，全血在室温下储存24-48小时后再处理已被证明会增加GRA污染。因此，延迟PBMC处理会影响样本质量，进而影响下游检测。延长储存诱导的GRA污染已被证明与T细胞功能降低、干扰素-γ ELISPOT斑点计数减少以及T细胞代谢通路活性改变相关。因此，在PBMC处理过程中避免RBC和GRA污染至关重要。

本研究旨在报告新型细胞分离装置FlowMagic?的性能，该装置采用专利技术，在从血液中分离PBMC时防止RBC和GRA污染。我们通过自动细胞计数器和流式细胞术评估了PBMC的回收率和纯度。

材料与方法

PBMC分离

从健康志愿者静脉采集血液至肝素钠管中，获取书面同意，遵循涉及人类受试者的生物医学研究指南。研究方案经H.U. Group Holdings, Inc.伦理审查委员会机构审查委员会批准（批准号：24-015-00, 24-015-02）。研究期间从2024年4月15日至2026年3月31日。每次采血前均获得志愿者参与者的书面知情同意。本研究志愿者招募于2024年4月25日开始，2024年11月15日结束。

新鲜全血样本在采集后立即在室温（20–24°C）下孵育。在同一志愿者采集血液后24、48和72小时内，通过三种不同技术并行进行PBMC分离。使用Lymphoprep（密度1.077 g/mL；STEMCELL Technology）与FlowMagic?管（内部开发）、Lymphoprep与SepMate管（STEMCELL Technology）以及单独使用Lymphoprep（STEMCELL Technology）在50 mL聚丙烯管（Wako）中按照内部方案和制造商说明进行操作。

FlowMagic?的三维CAD图像、FlowMagic?分离流程以及三种分离方案总结在图1和图2中。对于FlowMagic?技术，将15 mL Lymphoprep加入FlowMagic?管中，离心（1,200 g，10分钟，刹车开启）5分钟。肝素化血液用含有2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲盐水（PBS；FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）稀释两倍，并注入FlowMagic?上插入件的喷嘴孔中。离心后（1,200 g，10分钟，刹车开启），用塑料吸头按下漂浮的上插入件，通过将上清液倒入50 mL聚丙烯管（Wako）中收集PBMCs。对于SepMate技术，肝素化血液用含有2% FBS的PBS稀释两倍，并铺在Lymphoprep上。离心后（1,200 g，10分钟，刹车开启），通过将上清液倒入50 mL聚丙烯管中收集PBMCs。对于Lymphoprep技术，肝素化血液用含有2% FBS的PBS稀释两倍，并铺在50 mL聚丙烯管中的Lymphoprep上。离心后（1,200 g，20分钟，无刹车），使用塑料移液器收集PBMCs并储存于50 mL聚丙烯管中。收集的PBMCs用含有2% FBS的PBS洗涤两次（500 g，10分钟和5分钟，刹车开启）。使用Microsemi LC-710（HORIBA）自动细胞计数器进行细胞计数。

PBMC群体的免疫表型分析

通过流式细胞术进行免疫表型分析。PBMC样本使用Multitest 6-Color TBNK染色试剂盒（Becton Dickinson）进行染色。样本使用BD FACSLyric系统（BD Biosciences）测量，并使用FlowJo软件v10进行分析。

统计分析

为评估FlowMagic?方法与两种商业可用方法之间的差异，进行了配对比较：FlowMagic? versus SepMate和FlowMagic? versus Lymphoprep。使用Wilcoxon符号秩检验与Bonferroni校正进行多重比较作为非参数替代方法。所有统计检验中p值小于或等于0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析均使用Python版本3.13.5进行。

结果

FlowMagic?减少PBMC分离过程中的RBC和GRA污染

进行了三种分离方法：FlowMagic?管与Lymphoprep，记为FlowMagic?；SepMate管与Lymphoprep，记为SepMate；以及普通管与Lymphoprep，记为Lymphoprep。图1显示了FlowMagic?的专利 pending三维CAD图像，该装置由50 mL聚丙烯管中的两个插入件组成。与以前的细胞分离装置不同之处在于，上插入件设计为在离心过程中在管内漂浮。图2显示了FlowMagic?分离流程以及关于离心时间、速度和收集方案的三种方案的全面示意图比较。首先，我们通过这三种不同的分离方法检查了从十名志愿者全血中回收PBMCs的情况。使用每种方法在采血后24、48和72小时分离全血的分层状态如图3所示。上层含有血浆、分离介质和PBMCs。中层（界面）在FlowMagic?中含有少量RBCs和一些GRAs。下层在FlowMagic?中主要含有RBCs和GRAs。

图4a–c显示了使用三种分离方法（FlowMagic?、SepMate和Lymphoprep）在采血后24、48和72小时处理的全血样本中白细胞（WBC）、RBC和GRA计数的变化。在采血后24小时，所有三种方法均未观察到RBC污染（图3a和图4b）。

FlowMagic?甚至在采血后72小时仍能显著降低RBC污染至检测限以下（Q₅₀=0.0，IQR：0.0–0.0），与SepMate（Q₅₀=11.0，IQR：8.8–19.5；p < 0.01）和Lymphoprep方法（Q₅₀=9.3，IQR：6.6–13.5；p < 0.01）相比（图4b）。此外，FlowMagic?方法（在48小时Q₅₀=2.5，IQR：0.5–3.4；在72小时Q₅₀=4.5，IQR：2.1–10.3）在采血后48和72小时显著降低了GRA污染，与SepMate（在48小时Q₅₀=12.0，IQR：7.8–25.5；在72小时Q₅₀=27.5，IQR：12.3–29.0；p < 0.01，p < 0.01）和Lymphoprep方法（在48小时Q₅₀=10.5，IQR：6.9–19.8；在72小时Q₅₀=17.5，IQR：13.3–23.5；p < 0.01，p < 0.01）相比（图4c）。主要PBMC组成数据的总结见S1表。这些结果提示了FlowMagic?减少RBC和GRA污染的功效。

接下来，我们评估了通过三种不同分离方法从全血中分离的PBMCs的纯度和组成（图5）。在采血后72小时，使用FlowMagic?分离的PBMCs（Q₅₀=67.2，IQR：61.5–69.6，p < 0.01）显示出显著高于SepMate（Q₅₀=56.6，IQR：50.0–62.2，p < 0.01）和Lymphoprep（Q₅₀=56.0，IQR：49.0–59.4，p < 0.01）的淋巴细胞纯度率（图5a）。在采血后72小时，使用FlowMagic?分离的PBMCs也产生了显著多于SepMate和Lymphoprep的单核细胞（图5b）。在采血后48和72小时，使用FlowMagic?分离方法时，分离的PBMC中GRA污染率显著降低（图5c）。淋巴细胞组成数据的总结见S2表。

群体组成

然后我们通过流式细胞术评估了分离的PBMC组分中功能检测感兴趣的 leukocytes 的组成，即：T细胞（CD3⁺）、辅助T细胞（CD4⁺）、细胞毒性T细胞（CD8⁺）、B细胞（CD19⁺）和NK细胞（CD16/56⁺）。分离的PBMC群体的组成在志愿者之间有所不同，但总体上，从FlowMagic?分离的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺和CD16/56⁺细胞的百分比高于从SepMate和Lymphoprep分离的（图6a-6e），直至采血后72小时。与SepMate和Lymphoprep相比，FlowMagic?富集 leukocytes 的改善在采血后48和72小时更为显著（图6a-6e）。在采血后48和72小时， leukocytes 的百分比存在明显下降，这可能是由于少量GRA污染的积累所致（图5c）。淋巴细胞和 leukocytes 组成数据的总结分别见S2和S3表。总体而言，这些结果提示了FlowMagic?分离方法从血液中富集 leukocytes 的功效。

讨论

本文中，我们报告了新型细胞分离装置FlowMagic?的功效。评估了三种PBMC分离技术，重点关注细胞回收和群体组成。这些技术包括使用FlowMagic?装置与Lymphoprep进行分离、使用SepMate管与Lymphoprep进行分离以及仅使用Lymphoprep。从成本角度看，Lymphoprep分离是最有吸引力的方法，但在实践中，该技术相对繁琐、耗时比其他两种方法长，且受到RBC和GRA污染的困扰。SepMate提高了WBC的产量并减少了处理时间，但存在RBC和GRA污染问题。这种污染在血液处理延迟延长时变得更加明显。因此，我们提出FlowMagic?是一种优越的替代方法，因为即使在采血后48和72小时处理的分离PBMCs中，它产生的RBC和GRA污染也显著低于SepMate和Lymphoprep分离方法。此外，即使在采血后48和72小时，FlowMagic?分离的PBMCs中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺和CD16/56⁺细胞的回收率也显著高于SepMate和Lymphoprep分离的PBMCs。基于这些发现，FlowMagic?有潜力解决采血后样本处理长时间延迟（特别是在采血后48-72小时）发生的RBC和GRA污染问题。

在海外临床试验中，采血后的运输时间可能需要24-48小时，长时间的运输会降低PBMCs的质量。即使在这种情况下，FlowMagic?也可以成为高纯度分离PBMC的有效解决方案。总体而言，FlowMagic?方法表现出卓越的功效，实现了完全去除RBC污染和显著减少GRA污染，超越了常用分离技术的性能。需要进一步研究来评估使用FlowMagic?装置分离的PBMCs如何影响通常受RBC污染困扰的细胞功能检测。

在使用SepMate方法和Lymphoprep方法进行PBMC分离期间，全血铺在密度梯度介质上，因此全血和密度梯度介质不混合。相比之下，FlowMagic?分离方法由于离心前降低上插入件而混合了密度梯度介质和全血（图2a）。由于FlowMagic?分离方案中的这一步骤，FlowMagic?的一个缺点是无法在PBMC分离的同时分离血浆。FlowMagic?无法同时分离血浆可能与转化医学环境相关。功能下游检测（例如，细胞因子释放、ELISPOT）尚未呈现，应承认是未来需要的工作。

结论

我们提出，与单独使用Lymphoprep或其他商业细胞分离装置（如SepMate）相比，FlowMagic?是一种有用的工具，用于从采血后处理延迟24-72小时的样本中分离出低水平RBC和GRA污染的PBMCs。我们的结果报告了从全血中分离PBMC的功效，但显然需要利用体外细胞功能检测进行更广泛的研究。本研究提示，新开发的细胞分离装置FlowMagic?可能在实验室检测和细胞培养系统等领域有用。