综述：干细胞无细胞疗法促进健康脑老化：机制、挑战与前景

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Stem cell-free therapy for healthy brain aging: Mechanisms, challenges, and prospects

本综述系统阐述了干细胞分泌组（Secretome）及其细胞外囊泡（EVs）在靶向脑衰老关键机制（如神经炎症、线粒体功能障碍、细胞衰老）中的最新进展，强调了这种无细胞疗法相较于传统干细胞移植在安全性（避免成瘤性、免疫排斥）和靶向性（跨越血脑屏障BBB）方面的优势，并探讨了其临床转化面临的挑战与标准化生产（GMP）要求，为神经退行性疾病（AD、PD等）的防治提供了新视角。

　　

引言

衰老是一个极其复杂的过程，伴随着结构、功能和生理功能的衰退。目前已有超过300种衰老理论，其中氧化应激、线粒体功能和细胞衰老日益受到关注。在分子和细胞水平上，衰老的特征是损伤累积、基因表达改变、蛋白质稳态丧失、干细胞耗竭和代谢改变。衰老影响着分子、细胞和系统三个层面的变化。根据美国国家老龄化委员会的数据，约92%的老年人患有一种与年龄相关的疾病，而77%的人患有两种或以上。最常见的疾病包括神经系统疾病、心脏病、糖尿病、缺血性中风、退行性关节疾病、皮肤和毛发恶化，甚至癌症。

脑衰老的相关变化

血脑屏障（BBB）

血脑屏障是大脑和血流之间的选择性通透界面，严格调节物质交换并维持中枢神经系统的稳态。在衰老过程中，血脑屏障功能受损，导致神经退行性疾病。衰老小鼠的研究表明，脑组织中IgG浸润增加，occludin水平降低，血管周围周细胞覆盖减少。GLUT1转运蛋白功能改变导致葡萄糖通过血脑屏障的摄取减少。

小胶质细胞极化与神经炎症

小胶质细胞是中枢神经系统内主要的免疫细胞类型，占脑实质细胞含量的16%。衰老相关的神经炎症中，小胶质细胞表现出稳态基因的下调和载脂蛋白E（Apo E）表达的增加。ApoE介导的多种基因表达协调了各种代谢途径，并诱导神经退行性表型小胶质细胞的吞噬作用。

神经发生与血管化

神经干细胞（NSCs）在胚胎期产生大量神经元，但这种能力随着衰老而下降。神经发生的减少与成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的表达减少有关。生长分化因子-11（GDF-11）可促进老年小鼠的脑血管完整性并恢复神经发生。蛋白质稳态对于管理神经干细胞的增殖和分化至关重要。衰老相关的神经发生减少也可归因于线粒体功能障碍。

干细胞分泌组和EVs在年龄相关神经退行性疾病中的作用

干细胞分泌组是指细胞在微环境中分泌的完整生物分子阵列，包括可溶性蛋白质（如生长因子、细胞因子、趋化因子）、细胞外基质成分、信号肽、脂质和细胞外囊泡（EVs）。EVs是小的球形分泌物，被磷脂双分子层包围，根据其大小和生物发生主要分为外泌体（30-150 nm）、微囊泡（100-1000 nm）和凋亡小体（500-2000 nm）。EVs的主要成分是蛋白质、脂质和核酸。

EVs的一个显著优势是它们能够穿越血脑屏障。在衰老的大脑中，EVs可以通过转移抗炎细胞因子和miRNA来调节衰老的标志，包括神经炎症、线粒体功能障碍、氧化应激和细胞衰老。它们通过递送生长因子和miRNA簇（如miR-133b和miR-17-92）促进神经发生和突触可塑性，并通过线粒体RNA和抗氧化蛋白增强线粒体功能并减少氧化损伤。EVs有助于调节小胶质细胞表型，减少有害的M1表型的增殖。

阿尔茨海默病（AD）

AD的疾病进展主要由端粒缩短不足、表观遗传修饰、线粒体功能失调和星形胶质细胞衰老引起。牛脐带间充质干细胞（UC-MSC）来源的分泌组在大鼠AD模型中上调了脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF），同时下调了炎症因子如IL-1β和TNF-α，并增加了神经元保护。研究表明，MSC来源的EVs通过向神经元递送miR-133b来促进神经突发育。神经干细胞（NSC）分泌组通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路改善了AD小鼠模型的记忆保留并减少了Aβ斑块沉积。

帕金森病（PD）

神经炎症、线粒体应激和蛋白质稳态等衰老途径已知会促进PD。PD的风险也因DNA修复缺陷、表观遗传特征改变、营养感应不足和细胞死亡而增加。在PD大鼠模型中，整个干细胞分泌组及其囊泡组分都能够挽救症状并促进神经祖细胞的分化。人脐带血MSC（hUCB-MSC）来源的外泌体能够在体外下调SH-SY5Y细胞凋亡，并能够穿越血脑屏障，在体内减少多巴胺能神经元损失，减轻阿扑吗啡诱导的旋转对称性，并增加纹状体中的多巴胺水平。

多发性硬化（MS）

多发性硬化是一种自身免疫性神经炎症和神经退行性疾病，导致进行性神经、认知和身体残疾。脂肪来源的间充质基质细胞分泌组抑制了MOG诱导的脾细胞增殖，并降低了IFN-γ和IL-17的水平，同时上调了IL-4和T调节细胞。沃顿胶来源的MSC（WJ-MSC）分泌组给药减轻了炎症细胞浸润，增加了神经营养因子的表达，导致髓鞘再生和神经学评分的改善。

其他神经系统疾病

干细胞来源的无细胞疗法也被研究用于治疗其他神经系统疾病，如亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和癫痫。在这些疾病中，干细胞分泌组和EVs已被证明具有调节炎症、防止神经元损失和促进神经修复的能力。

分泌组功能的机制洞察及其治疗潜力

分泌组成分通过靶向各种细胞信号通路来改善衰老的影响，最显著的是通过调节自噬过程。自噬是通过溶酶体依赖机制清除细胞内功能失调蛋白质的过程。在DNA修复受损的小鼠中，雷帕霉素机制靶点（mTOR）的过度激活会损害肌肉来源的干细胞，而使用雷帕霉素治疗通过刺激自噬可以恢复其功能。分泌组中的生长因子据报道可以增加去乙酰化酶1（SIRT1）的活性，SIRT1可以通过对组蛋白和非组蛋白去乙酰化来影响衰老过程中的细胞过程。

分泌组的治疗潜力可能通过使用各种组合方法而受益。分泌组可以与药理学小分子或天然来源的化合物（如褪黑激素、多糖、类黄酮、多酚和醛类）结合使用，这种组合可能协同作用以增强治疗效果。此外，CRISPR-Cas9技术为定制细胞的输出开辟了新天地。例如，在MSC中过表达基质细胞衍生因子-1（SDF-1）据报道可以改善血管条件和肿瘤生长。

干细胞分泌组和EVs的临床转化

尽管干细胞分泌组和EVs对于神经性和年龄相关疾病的临床前前景广阔，但已发表的临床结果仍然很少，大多数结果来自早期阶段或正在进行的试验。一项临床前到临床的转化研究表明，在中年晚期小鼠中鼻内递送hiPSC来源的神经干细胞EVs可减轻神经炎症和氧化应激，同时增强认知功能。

尽管具有显著的治疗潜力，但在临床采用之前仍需克服多个转化挑战。标准化和批次一致性是关键问题，因为供体变异性、细胞培养条件和纯化方法导致EV和分泌组组成的显著异质性，使可重复性和监管批准复杂化。可扩展性和GMP合规性是下一个限制因素。剂量、安全性和药代动力学是另一个障碍，因为最佳的给药方案、递送途径和给药频率仍未确定。细胞游离疗法的监管和质量控制框架仍在发展中。

GMP生产要求

根据WHO以及ICMR和DBT的国家干细胞研究指南，细胞游离产品的生产和商业化需要遵守GMP（良好生产规范）和GCP（良好临床实践）标准。这包括涉及设施、环境控制、无菌处理、文件记录、产品表征、监管批准、标签、批间质量控制和上市后监测的多个过程。

当前挑战与细胞游离疗法的未来方向

尽管关于细胞游离疗法的结果令人鼓舞，但由于缺乏制备、表征和大规模生产的标准化方案，分泌组和EVs的应用仍然有限。分泌组在不同批次间效价和功效的不一致可归因于细胞来源、分离技术和培养条件的差异。监管机构要求在对分泌组作为产品批准之前，要有严格、可重复的过程和表征。

利用循环生物标志物监测衰老进程可能为了解疾病进展和患者状况提供有价值的见解。衰老的生物标志物可大致分为分子和细胞、基于图像、基于临床测量和复合衰老生物标志物。研究最广泛的与衰老相关的生物标志物之一是端粒长度，因为人类体细胞由于端粒进行性缩短而经历有限的复制寿命，从而增加了其对突变的易感性。

结论

在生理和病理水平上应对衰老存在诸多挑战。利用干细胞分泌组在对抗衰老影响方面具有巨大潜力。通过调节不同的通路，干细胞分泌组有助于对抗氧化应激、线粒体功能障碍、干细胞 rejuvenation 和减轻DNA损伤。分泌组成分，如NRF2、P38 MAPK和PI3K AKT，可以协同激活各种通路。干细胞分泌组的抗炎特性增加了其治疗益处，并可以靶向各种与衰老相关的疾病。

通过调节与氧化应激、细胞 rejuvenation 和炎症相关的主要衰老相关信号通路，干细胞分泌组可以为关节退变、心血管疾病、细胞衰老和神经系统疾病提供额外的干预措施。iPSC和MSC分泌组都具有优势；前者由于其多能性而具有更强的再生特性，后者已知具有更好的抗炎特性。给药部位和靶向器官在选择分泌组或EVs作为疗法时起着重要作用。