综述：加速适应性实验室进化：进化生物技术的工具

《Biotechnology Advances》：Accelerated adaptive laboratory evolution: A tool for evolutionary biotechnology

本综述系统阐述了加速适应性实验室进化（aALE）这一前沿生物技术，重点介绍了如何通过提高突变率和遗传多样性来克服传统适应性实验室进化（ALE）耗时长的局限性。文章详细比较了各类进化工程工具的便携性、基因组靶向性和可靠性，为微生物菌株进化提供了实用的选择框架，并展望了其与计算建模、自动化等技术结合的未来方向，对工业生物技术领域的菌株开发具有重要指导意义。

　　

Abstract

适应性实验室进化（ALE）是一种通过利用受控环境中自然选择原理来增强微生物特性的强大策略。它已在多种生物体中实现了微生物生长、胁迫耐受性和产物产量的显著进步，同时为进化机制提供了见解。然而，传统的ALE工作流程耗时且资源密集，依赖于长时间的培养以使有益突变出现并在群体中保持。为了改进这一点，一系列进化工程工具被开发出来，通过提高进化菌株的突变率和遗传多样性来加速ALE。本综述探讨了塑造ALE的核心参数，如选择压力、传代方法和传代规模，并全面概述了既有的和新兴的加速方法。这些技术根据便携性（在不同微生物中的适用性）、基因组靶向性（诱变的特异性）和可靠性（最小的脱靶突变和突变可重复性）进行分类，最终的选择框架总结在文末的表3中。我们强调了加速ALE日益增长的应用潜力，并概述了未来方向，包括整合全基因组和靶向诱变、计算建模、实验室自动化以及扩展到模式生物以外的更广泛应用。本综述旨在简化加速ALE的使用，释放其在推进微生物菌株工程方面的真正潜力。

Introduction

工业生物技术，在代谢工程和合成生物学进步的推动下，正通过可持续生产各种产品（从酶、药品到化学品和生物燃料）为知识型、循环型和生物基经济奠定基础。代谢工程通过合理设计de novo生物合成途径，已在微生物生产有价值代谢物（如1,3-丙二醇、黄酮类化合物、十一烷和其他脂肪酸）方面实现多项突破。然而，将野生微生物转化为高效、稳健和具有生产力的微生物细胞工厂仍然充满挑战。原生代谢网络的复杂性需要精确调整以将通量导向目标产物，同时不损害生长或稳定性。工程化途径经常与宿主的天然代谢竞争，这可能降低产物产量并损害整体菌株性能。此外，工业规模的生物反应器使微生物菌株暴露于动态环境胁迫下，例如波动的pH、温度、溶解氧水平、营养浓度和有毒副产物。这些变化的条件会影响细胞生理和代谢，常常损害细胞生长和产物形成。缺乏稳健性（定义为菌株在变化条件下的稳定性）会影响滴度和产量，并限制工业规模的微生物生产。尽管通过基因过表达、缺失或动态途径调控的合理工程已产生改进的滴度和途径控制，但它仍然严重依赖于对宿主代谢途径的全面了解。实际上，这种知识往往是不完整的。此外，仅靠合理设计可能不足以应对诸如在发酵过程中保持基因组稳定性、在波动条件下维持生产力以及确保可变反应器微环境中广泛的胁迫耐受性等挑战。进化工程通过产生广泛的表型多样性，然后选择改进的性状来规避这些限制。与合理方法不同，它不需要事先了解实现所需功能所需的遗传变化。相反，微生物群体在选择压力（如升高的温度、降低的pH或非天然碳源）下持续进化，以富集有益突变。

一种广泛使用的进化工程技术是适应性实验室进化（ALE）。在ALE中，生物体通常被置于胁迫环境中，选择那些通过适应特定基因组编码过程而存活的细胞。这个过程模拟了自然进化，其中产生进化优势的突变被传递下来，以便在胁迫和/或资源有限的环境中生存。ALE已成功应用于优化不同培养基上的生长，例如改善Escherichia coli (E. coli)在以甘油、葡萄糖或乳酸为碳源的基本培养基上的生长，以及允许在非天然碳源L-1,2-丙二醇上生长。此外，ALE已被用于增加对各种微生物的环境胁迫抗性，包括渗透压、酸性和氧化胁迫。除了胁迫适应，ALE还改善了产量和微生物生长；例如，ALE在两种Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum)菌株（L-谷氨酸和L-赖氨酸生产的关键生物）中将生长速率提高了20%，并减少了拉格酵母Saccharomyces pastorianus (S. pastorianus)的$\alpha$-乙酰乳酸产量，从而增强了拉格啤酒的风味特征。然而，局限性仍然存在，因为ALE需要长时间的培养以使有益突变出现并在群体中保持，这使其成为一种耗时且资源密集的方法。根据实验设置和期望结果，ALE选择时间可以从25天到8个月，甚至2年。特殊情况下，可能需要长达15年，如著名的Lenski长期进化实验。

加速ALE过程显著扩展了其适用性，特别是在工业环境中。传统上，加速是通过使用既有的、众所周知的技术来实现的，例如物理和化学诱变。这些既有技术简单、成本效益高且应用广泛，但它们也可能引入随机突变，从而降低菌株适应度或导致遗传不稳定性。为了解决这些缺点，进化生物技术（将进化工程与生物技术工具相结合）近年来受到更多关注。这些先进方法提高了突变特异性和稳定性，同时加速了菌株开发。这些既有和新兴技术通过缩短产生所需表型所需的时间、降低总体成本和提高筛选效率，实现了加速ALE（aALE）。随着对进化生物技术的兴趣日益增长，一系列用于aALE的技术已经出现，每种技术都有独特的优势和局限性。因此，有必要选择一种与特定实验所需结果、时间线和精度相兼容的加速技术。

本综述旨在全面概述当前加速ALE的技术，突出其独特特点，并为未来研究中选择合适的策略提供指导，特别是在工业生物技术的背景下。首先，讨论ALE的基本原理，包括其优势和局限性。接下来，介绍用于加速ALE的各种生物技术工具，重点介绍其应用和特性，如可靠性、便携性和突变范围。最后，讨论探讨了当前的局限性并概述了有希望的未来方向，这些方向可以进一步扩展aALE的威力和精度。

Adaptive laboratory evolution

ALE是一种用于基础研究和工业应用的强大方法。从根本上说，ALE有助于阐明进化原理和微生物适应过程，例如揭示在非天然底物上生长、环境胁迫响应和交叉胁迫抗性的遗传基础。随着测序成本的下降和可及性的提高，ALE实验可提供的信息量也在增加。

Accelerated adaptive laboratory evolution

aALE建立在ALE的基础上，采用提高突变率和遗传多样性的策略，使有益突变更快出现。这是通过使用进化工程工具来实现的，这些工具产生多样化的基因组文库（称为ALE文库），作为进化实验的起始群体。此外，根据所应用的技术，诱变和多样化可以在整个ALE过程中持续进行。

Towards the next generation of adaptive laboratory evolution

通过实现无需事先基因组知识的微生物菌株开发，ALE为工业生物技术提供了一种独特灵活且广泛应用的方法。随着高通量测序的可用性增加和成本下降，以及分析数据的生物信息学工具的发展，测序方法将继续进步并增强可从ALE实验中提取的信息量。通过应用明确的选择压力，aALE可以推动微生物群体朝向所需表型进化。