RPE65基因敲除非洲爪蟾视网膜功能保留机制研究：揭示不依赖RPE65的视觉光感受新途径

《Experimental Gerontology》：RPE65 knockout Xenopus laevis have a compromised but detectable electroretinogram and altered visual responses, without retinal degeneration or altered melanophore dispersion.

本文通过CRISPR/Cas9技术构建RPE65基因完全敲除的非洲爪蟾模型，发现其视网膜虽缺乏可检测的视紫红质(rhodopsin)但保留显著的光反应功能，且无进行性退行性变。该研究为探索脊椎动物中不依赖RPE65的视觉循环(visual cycle)替代通路提供了重要模型，对莱伯先天性黑蒙(LCA)基因治疗策略具有启示意义。

　　

章节亮点

繁殖

通过先前描述的方法获得F0代RPE65编辑动物（Tam等人，2024）。将这些动物培育至性成熟后与野生型(WT)杂交，并通过桑格测序对后代胚胎进行分析（Feehan等人，2017；Ghaseminejad等人，2022）。选择能够高效传递RPE65.L和RPE65.S基因敲除等位基因的雄性和个体进行互交，并通过桑格测序筛选F1代动物。

基因修饰X. laevis的生成

我们前期研究发现X. laevis拥有两个编码RPE65的基因（RPE65.S和RPE65.L），并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了F0代基因敲除动物（Feehan等人，2019，2017；Tam等人，2024；Wen等人，2019）。现将这些嵌合创始人动物培育至成熟，经过两代杂交获得所有四个RPE65等位基因均携带移码突变的稳定品系（补充材料图S1）。

讨论

我们前期构建RPE65编辑X. laevis旨在研究视黄醛在视紫红质(rhodopsin)突变致视网膜变性中的作用（Tam等人，2024），以及视黄醛在视杆细胞自噬调控中的功能（Wen等人，2019）。本研究成功建立具有四个RPE65等位基因移码突变的X. laevis品系，其完全缺失RPE65表达并表现出相应表型。该品系为研究脊椎动物中不依赖RPE65的光感受机制提供了新型模型系统。

结论

RPE65敲除X. laevis展现出独特的视网膜特征：视杆细胞外段缩短且缺乏可检测的视紫红质，但光感受器无进行性退化。视网膜电图(ERG)显示其在暗适应(scotopic)和明适应(photopic)条件下仍保留显著光反应，同时行为学光敏感性降低而黑素细胞光分散反应正常。该模型为探索RPE65非依赖性视觉通路提供了理想平台。