RGD肽修饰藻酸盐微管三维培养哺乳动物细胞：解决培养肉大规模生产瓶颈的新策略

《Future Foods》：Culturing Mammalian Cells in RGD Peptide-Modified Alginate Hydrogel Microtubes

本研究针对培养肉工业化生产中细胞大规模扩增的技术瓶颈，开发了一种基于RGD肽修饰藻酸盐水凝胶微管（AlgTubes）的新型微生物反应器系统。该系统为贴壁依赖型细胞提供了友好的三维微环境，有效促进物质传输并减少剪切应力，使小鼠（C2C12）和鹌鹑（QM7）成肌细胞密度突破1.0×108 cells/mL，较传统搅拌釜生物反应器提升一个数量级，并可诱导分化为成熟肌管。该创新系统显著降低培养体积与生产成本，为培养肉的大规模经济生产提供了突破性解决方案。

　　

随着全球人口预计在2050年达到90亿，传统畜牧业面临资源密集和环境不可持续的双重压力。培养肉（cell-cultured meat）作为一种通过体外扩增动物细胞生产肉类的新兴技术，为补充传统肉源提供了 promising 解决方案。然而，该行业面临一个重大挑战——如何实现大规模、成本效益高的细胞生产。目前，动物细胞在传统生物反应器（如搅拌釜反应器，STR）中培养密度有限，通常仅约10⁶ cells/mL，且易受剪切应力损伤和细胞聚集问题困扰。因此，开发能够支持高密度三维（3D）细胞生长、最小化剪切应力并便于细胞收获的新型培养平台至关重要。

在这项发表于《Future Foods》的研究中，Wang Ou等人开发了一种基于RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）肽修饰的藻酸盐水凝胶微管（AlgTubes）的微生物反应器系统，旨在解决培养肉生产中的规模化难题。研究人员通过化学方法将RGD肽接枝到藻酸盐聚合物上，使其具备支持细胞粘附的能力。利用定制微挤出器，将细胞悬液和藻酸盐-RGD溶液分别泵入中心通道和侧通道，形成同轴核壳流，挤出至氯化钙（CaCl₂）缓冲液中瞬间交联形成中空水凝胶微管。细胞在微管内壁附着和生长，受到水凝胶壳的保护，避免了剪切应力，并限制了细胞团块的径向尺寸，确保了高效的物质传输。

研究结果显示，小鼠成肌细胞系C2C12在AlgTubes中培养19天后，细胞密度达到1.1×10⁸ cells/mL，是传统STRs的十倍以上。细胞存活率高，并可自发或经诱导（更换为含马血清的分化培养基）分化为表达MF20、MyoD和PAX7等标志物的成熟肌管，肌管沿微管方向排列。与小鼠骨髓基质细胞系D1或成纤维细胞系3T3共培养能进一步提高细胞产量，分化条件下联合培养密度可达1.6×10⁸ cells/mL。鹌鹑成肌细胞系QM7在AlgTubes中也表现出类似的高密度生长和分化能力，但细胞行为与C2C12略有不同，更倾向于形成3D聚集体。相比之下，小鼠前脂肪细胞系X9在AlgTubes中生长缓慢，最终密度为3.5×10⁷ cells/mL，提示不同细胞类型对该系统的适应性存在差异。

C2C12 expansion in AlgTubes

通过定时显微观察和活/死细胞染色，证实C2C12细胞在AlgTubes内能有效附着、增殖并形成多层细胞团块，最终达到高细胞密度，并伴有自发性肌管分化。

C2C12 differentiation in AlgTubes

在诱导分化条件下，C2C12细胞能成功分化为成熟的肌管，免疫荧光染色证实了肌纤维特异性蛋白的表达和细胞核的排列。

C2C12 and D1 co-culture

共培养实验表明，基质细胞的存在不影响C2C12的分化，并能轻微提升最终细胞产量，模拟了肉组织中多种细胞类型共存的环境。

QM7 expansion in AlgTubes

QM7细胞在AlgTubes中展现出高密度生长潜力，但其更易形成密集聚集体，导致后期局部细胞死亡增加。

Quail cell differentiation in AlgTubes

鹌鹑成肌细胞在AlgTubes中同样可被诱导分化为肌管，证明了该系统对不同物种细胞的适用性。

QM7 and 3T3 cell co-culture

QM7与3T3细胞的共培养进一步验证了多细胞类型共同培养的可行性，并观察到产量的提升。

X9 expansion in AlgTubes

X9前脂肪细胞的缓慢生长表明AlgTubes系统对快速增殖的成肌细胞更具优势，为培养脂肪组织提供了初步探索。

综上所述，本研究开发的RGD-AlgTubes系统成功克服了传统生物反应器在培养动物细胞时的多个关键限制，包括低细胞密度、剪切应力敏感、细胞收获复杂等。通过实现超过10⁸ cells/mL的细胞密度和高达100倍的每批次扩增倍数，该系统能显著减少培养体积、劳动力、试剂消耗和设备需求，从而大幅降低生产成本。尽管存在细胞生长速率略慢于2D培养、水凝胶管可能弯曲以及规模化生产等有待进一步优化的问题，但AlgTubes平台为培养肉产业实现大规模、经济可行的生产目标提供了极具潜力的技术路径。该研究首次报道了RGD修饰的AlgTubes及其在细胞培养中的应用，标志着培养肉生产技术向前迈出了重要一步。