综述：用于培养肉生产的生物反应器参数与系统

《Future Foods》：Bioreactor parameters and systems for cultured meat production

本综述系统阐述了培养肉（CM）生产中的关键生物反应器参数（如pH、O2、CO2、温度与细胞密度）及主流反应器系统（搅拌罐、中空纤维、摇动式、气升式与固定床），并深入探讨了机械/电/化学刺激对细胞分化的调控作用与规模化策略，为CM产业化提供了关键理论与技术参考。

　　

2. 培养肉生产的关键工艺参数

2.1. pH

pH通过影响氨基酸电离状态和蛋白质三维结构，直接调控细胞呼吸、营养吸收、代谢及分化过程。哺乳动物细胞最适胞外pH为7.3–7.4，而胞内pH因区室异质性呈现动态变化（如溶酶体pH 4.7，线粒体pH 8.0）。pH与CO₂浓度紧密关联：CO₂溶于水生成碳酸（H₂CO₃），解离为H⁺和HCO₃^–形成缓冲体系，同时温度波动可能通过改变自解离速率和电极灵敏度导致pH读数误差。代谢产物（如乳酸）的积累也会浓度依赖性地影响pH稳定性。

2.2. 氧气

氧气作为需氧生物过程的关键底物，是线粒体电子传递链的最终电子受体，参与ATP合成。组织中氧可用性通常以氧分压（pO₂）表示，直接影响细胞生长、分化与代谢。肌肉细胞在生理氧浓度（2–10%）下表现出增强的成肌分化，促进成肌细胞增殖并融合为成熟肌管；低氧张力可通过激活缺氧诱导因子（HIF）调控肌生成关键基因。脂肪细胞在5%氧浓度下脂质积累与成熟标志物（PPARγ、C/EBPα）表达显著提升。但过度氧暴露会诱发活性氧（ROS）积累，破坏Nrf2/MAPK等信号通路稳态，导致细胞损伤。

2.3. 二氧化碳

CO₂是细胞呼吸的主要产物，其分压（pCO₂）变化通过跨膜扩散降低胞内pH，影响酶活性与代谢路径，并进一步调节乳酸和铵离子水平。高pCO₂还会增加渗透压，间接影响代谢副产物积累。体外培养系统中通常维持5% CO₂以模拟生理条件（相当于37°C下50?70 mmHg pCO₂），其形成的碳酸/碳酸氢盐缓冲对为pH稳定提供支持。

2.4. 温度

温度直接调控酶活性、代谢速率、生长曲线及生物产物稳定性。哺乳动物细胞最适温度为37°C，低温（30–35°C）可提升某些蛋白产量，但低于34°C会延缓生长与代谢；高于39°C则诱发热休克反应，导致蛋白质错误折叠与细胞死亡。变温动物（如水产细胞）的最适温度范围较宽（15–30°C）。温度还通过影响O₂溶解度间接调控氧消耗效率。

2.5. 细胞密度

高细胞密度（HCD）培养是提升生物反应器产率的核心策略，但密度超过特定阈值（通常10⁶–2×10⁸ cells/mL）后，单细胞生产率会因营养/气体交换限制而下降。即使采用灌流或连续培养模式，细胞特异性机制仍可能限制系统整体产率。近期研究表明，去除胞外囊泡或过表达UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶可显著提高HEK293细胞的病毒样颗粒产量，提示胞内外机制共同参与密度效应调控。

3. 用于培养肉生产的主要生物反应器系统

3.1. 搅拌罐生物反应器（STR）

STR通过中央搅拌桨实现悬浮细胞/微载体混合，兼具设计简单、适应性强与易于放大优势，是目前CM生产的主流设备。其最大挑战在于搅拌产生的高剪切力对敏感细胞的损伤，以及微载体使用导致的细胞收获难题（需酶解 detachment）。采用可食用微载体可同步解决污染问题并改善终产品风味与质地。

3.2. 中空纤维生物反应器（HFB）

HFB利用半透性纤维束模拟血管结构，允许营养/废物交换的同时将细胞保留在纤维腔内，可实现极高细胞密度（>1×10⁸ cells/mL）与低剪切培养。但其放大过程中易形成浓度梯度，且纤维材料（聚砜、聚醚砜等）不可食用可能污染产物。开发可食用纤维材料是重要研究方向。

3.3. 摇动式生物反应器（RMB）

RMB通过柔性培养袋的摇动产生液波实现混合与气体交换，剪切力低且采用一次性耗材降低污染风险。但工作体积超过1000L后混合效率下降，且耗材成本较高。其简单袋式设计有利于降低成本和促进可再生材料应用。

3.4. 气升式生物反应器（ALB）

ALB通过底部气体注入驱动培养基循环，提供温和混合与高效氧传递，已实现300m3规模CM生产验证。但高粘度培养液易导致混合不均与细胞聚团，且气泡上升可能引发泡沫问题。

3.5. 固定床生物反应器（FBB）

FBB将细胞固定于静态床层支持基质上，培养基流经床层提供营养并移除废物，特别适合在支架上直接进行细胞增殖与分化。其单位体积培养表面积可达600m2，细胞密度超5×10⁸ cells/mL，但细胞收获难度大且传统支架材料（玻璃、聚丙烯等）不可食用。可食用基质开发是关键突破点。

4. 细胞分化的刺激因素

4.1. 机械刺激

培养基底刚度：基质刚度通过调控细胞骨架动力学与基因表达模式决定干细胞命运。软基质促进增殖与分化，而硬基质抵抗机械变化。

剪切应力：适度流体剪切力可通过激活PI3K/Akt、MAPK/ERK等通路促进成肌细胞融合与肌管形成，但需精确控制以避免损伤。

支架拓扑线索：对齐纤维或沟槽等表面结构可引导肌细胞排列与伸长，加速分化并提升肌肉特异性标志物表达；特定拓扑亦能促进脂肪细胞脂质积累与成熟。

4.2. 电刺激

电刺激（0.06–6 V/cm）通过模拟肌肉组织天然电信号促进成肌细胞对齐、分化与肌管形成，诱发Ca²⁺振荡并驱动肌节结构发育。其与导电支架联用可显著增强肌肉组织工程效果。

4.3. 化学刺激

营养组分：高葡萄糖（25 mM）提升成肌分化与脂质积累；谷氨酰胺及其二肽形式（如GlutaMAX）改善细胞增殖与分化；亮氨酸、精氨酸等必需氨基酸调控成肌与成脂过程。

生长因子与细胞因子：IGF-1/2通过自分泌作用促进成肌细胞分化与脂肪细胞成熟；IL-6与TNF-α通过复杂网络调控炎症反应、肌肉再生与脂肪生成。

4.4. 环境刺激

ECM组分：胶原蛋白I/IV、层粘连蛋白、纤连蛋白、透明质酸和玻连蛋白等通过提供结构支持与激活信号通路，协同调控成肌与成脂分化效率。

5. 培养肉生产的大规模策略

5.1. 放大策略：转移至大型生物反应器

通过增加单反应器工作体积（如250,000L）实现规模经济，但面临混合效率、氧/营养传递及热分布的非线性缩放挑战。高细胞密度导致的粘度上升会进一步限制传质效率。大型STR中局部浓度梯度与剪切力分布不均可能导致细胞行为异质性与产物质量波动。尽管抗体生产已实现20,000L规模，但CM生产需解决支架集成、结构仿生与剪切敏感性问题。

5.2. 并行策略：多生物反应器并联操作

通过多个小型反应器并联运行（缩放化）规避单一大反应器的工程挑战，确保过程一致性且降低单点故障风险。但该策略缺乏规模经济，操作成本较高，需依赖自动化控制系统实现多单元同步监控。智能生物反应器与智能补料策略是确保并行系统稳定运行的关键技术。

6. 结论

CM生产的成功依赖于生物反应器设计、工艺参数优化与细胞分化调控的多维度整合。反应器选型需权衡剪切力、放大潜力与产物收获难度；工艺参数（pH、O₂、CO₂、温度、细胞密度）需精细控制以维持细胞稳态；物化刺激策略（机械、电、化学）可有效提升分化效率与产物质量；放大与并行策略需根据实际生产需求与经济性灵活选择。未来研究应聚焦可食用材料开发、过程监控自动化与混合规模策略优化，以推动CM产业化进程。