澳大利亚昆士兰沿海水域中Gambierdiscus的分类学特征、分布情况及其栖息地关联

《Health Care Transitions》：Taxonomy, distribution, and habitat associations of Gambierdiscus from coastal waters off Queensland, Australia

Gambierdiscus多样性及环境关联性研究。通过DNA条形码技术分析昆士兰三海岸区Gambierdiscus物种多样性，发现新型遗传分支Clade II GBR及首次在内陆水域确认的G. holmesii，揭示物种分布与浅水礁区、宿主藻类（如Asparagopsis taxiformis）显著相关，并强调分子监测与多组学整合的重要性。

　　本研究由Joseph C. Perkins、Kyall R. Zenger、Angela Capper、Yang Liu和Jan M. Strugnell共同完成，主要聚焦于澳大利亚昆士兰沿岸地区，探讨了毒力强的浮游植物Gambierdiscus的多样性、空间分布及其与生态因子之间的关系。这些浮游植物是引起 ciguatera 毒素中毒的主要病原体，其对全球公共卫生和渔业构成重大威胁。Gambierdiscus 作为一种主要分布于热带和亚热带海域的生物，其分类学、生态学以及环境驱动因素仍存在许多未知领域，这限制了对ciguatera风险的监测和预测能力。因此，本研究采用了DNA metabarcoding技术，针对18S rRNA基因的V8-V9区域，分析了昆士兰多个沿海地点的Gambierdiscus物种多样性及分布特征，揭示了已知物种和潜在新菌株的存在，并发现了Gambierdiscus holmesii在Hervey Bay和Gladstone地区的首次确认检测，扩展了其地理分布范围。此外，本研究还首次记录了Gambierdiscus在Gladstone沿海区域的出现，进一步加深了对这一区域生态系统的理解。

### 1. 研究背景

ciguatera中毒是全球最常见的非细菌性海鲜疾病之一，每年估计有1万至5万例病例。这种疾病主要由食用了体内积累了ciguatoxins的海鲜（主要是鱼类）引起，而ciguatoxins则主要由底栖的Gambierdiscus属的浮游植物产生。尽管这些浮游植物广泛分布于热带和亚热带海洋生态系统中，但其生态学、分类学和环境驱动因素在许多地区仍不明确，限制了对ciguatera风险的监测和预测能力。因此，本研究采用了DNA metabarcoding技术，通过分析18S rRNA基因的V8-V9区域，来评估Gambierdiscus的多样性及其在昆士兰沿海地区的分布情况。研究结果揭示了已知的Gambierdiscus物种（如G. carpenteri和G. holmesii）以及一些潜在的新菌株，其中特别值得注意的是一个基因上高度不同的群体（Clade II GBR），这可能代表一个尚未描述的谱系。更重要的是，本研究首次在Hervey Bay和Gladstone地区确认了G. holmesii的存在，这一已知的ciguatoxin产生者，将其地理分布范围从远离海岸的珊瑚礁扩展到了近岸的珊瑚礁和沿海环境。同时，这也是首次在Gladstone沿海地区记录到任何Gambierdiscus物种。研究还发现，Gambierdiscus的组成受到大型藻类宿主的影响，而浅水珊瑚礁环境支持了最高的物种多样性和检测频率，表明这些环境可能是生态热点区域。

### 2. 方法

本研究的样本采集覆盖了昆士兰三个沿海地点：Townsville、Gladstone和Hervey Bay。每个地区选取了多个样本点（Townsville n=4，Gladstone n=5，Hervey Bay n=5），并在每个样本点进行了五次重复采样和一次现场对照采样。选择这些地点基于其丰富的底栖栖息地和历史上发生ciguatera中毒的记录。然而，目前对这些地区Gambierdiscus的分布和多样性缺乏系统的全面研究。这些地点靠近大型人口聚集区，进一步突显了本研究的生态和公共卫生意义。总共收集了70个样本和14个现场对照样本。这些样本在雨季期间采集，即2022年11月9日至2023年1月11日，这一时期以热带和亚热带地区的降雨量增加和水温升高为特点。

DNA提取在詹姆斯·库克大学的环境DNA（eDNA）实验室进行，采用的方法基于Perkins等（2025）的流程。简而言之，DNA从100 mL的水样和过滤后的大型藻类中提取，使用了preserve, precipitate, lyse, precipitate, purify（PPLPP）方法。为了监测污染，除了现场样本外，还包含了两个DNA提取对照样本。提取后的DNA进一步使用DNeasy PowerClean Pro Cleanup Kit进行纯化，以去除可能的抑制物。

在DNA测序之前，使用了两种常用的针对18S rRNA基因的引物对，以确定最合适的Gambierdiscus检测区域。V4区域使用了SSU556F/SSU911R引物，而V8-V9区域使用了18SV8FAlveolata/18SV9RAlveolata3引物。引物性能通过qPCR在DNA标准中进行评估，标准代表了两种Gambierdiscus物种：G. pacificus和G. carpenteri，涵盖从0.01 ng/μL到0.00001 ng/μL的稀释系列，重点关注较低浓度以更好地反映环境检测中通常遇到的微量DNA水平。为了评估分类学特异性，使用相同的稀释系列和标准，两种引物对也测试了非目标物种Gyrodinium aureolum，因为它在全球分布广泛且在系统发育上与Gambierdiscus不同。

qPCR反应在25 μL体积中进行，包含11 μL SYBR Green Master Mix、7.7 μL UltraPure H?O和1.65 μL每种引物（10 mM）。热循环在QuantStudio? 3 Real-Time PCR System上进行，条件包括初始变性98°C 10秒，随后45次循环在68°C 30秒，最后退火步骤在69°C 5分钟。熔解曲线分析从65°C到95°C进行，每次增加0.3°C，以评估扩增特异性。基于这一评估，选择了V8–V9引物对用于所有下游测序分析，因为其扩增性能更好且降低了非目标扩增的风险。

V8–V9区域（约394 bp）通过Alveolata特异性引物18SV8FAlveolata和18SV9RAlveolata3进行扩增，这些引物经过修改以包含Illumina Nextera overhang adapters。这一引物对的选择基于之前测试，证明了其对Gambierdiscus检测的特异性。PCR反应（25 μL）包含11 μL SYBR Green Master Mix、7.7 μL UltraPure H?O和1.65 μL每种引物（10 mM）。热循环条件包括初始变性94°C 2分钟，40次循环在68°C 10秒、58°C 30秒和68°C 25秒，最后在68°C 5分钟进行延伸。

总共处理了87个样本，包括现场样本、现场空白样本、提取空白样本和PCR空白样本。每个样本在三重重复中进行扩增，生成了261个PCR产物用于测序。库准备和测序在澳大利亚基因组研究设施（AGRF）进行，使用Illumina MiSeq技术，具有500周期的配对端化学方法。

测序数据使用RStudio中的DADA2流程进行处理（Callahan等，2017；R Core Team，2018）。读取过滤和修剪的参数包括最大预期错误（maxEE）=（2, 2）、无歧义碱基（maxN=0）、质量得分截断阈值（truncQ）=2、最小序列长度（minLen）=150和PhiX序列去除。处理在单线程模式（multithread=FALSE）中进行，输出文件压缩（compress=TRUE）。配对读取通过至少12个碱基重叠进行合并，去除嵌合序列。

生成的Amplicon Sequence Variants（ASVs）使用SILVA SSU Release 132数据库进行分类学分配，对齐于18S V8–V9区域（Gl?ckner等，2017）。潜在的污染物通过'decontam'包（Davis等，2018）进行识别和去除，应用基于频率的方法，阈值为0.5。去除污染物后，所有空白和对照样本都被排除，且读取次数为零的样本也被过滤掉。在后续分析中，仅保留了与Gambierdiscus属具有≥95%身份匹配的ASVs和读取。这一较低的%身份门槛是为了捕捉更广泛的Gambierdiscus序列多样性，允许通过系统发育位置探索潜在的新物种、菌株或未知变种。

### 3. 结果

本研究确认了V8–V9区域对于检测昆士兰沿海环境中的Gambierdiscus最为合适。qPCR测试显示，V8-V9引物在扩增效率和特异性方面均优于V4引物。对于Gambierdiscus pacificus，两种引物对均在完整稀释范围内（0.01 ng/μL至0.00001 ng/μL）进行扩增，但V8–V9引物生成了尖锐的单一熔解峰（约83–84°C），表明了特异性扩增。相比之下，V4引物生成了更宽泛、不明确的熔解峰，暗示了非特异性产物。性能差异在Gambierdiscus carpenteri的基因组DNA中更为明显。V8-V9引物在所有标准中一致扩增，Ct值在20到40个循环之间（图S4），而V4引物仅在较高浓度下产生弱扩增，并且未能检测到较低稀释。重要的是，V8-V9引物未能扩增任何Gyrodinium aureolum的DNA，而V4引物在较高浓度下产生了弱的、晚期循环扩增（图S6），表明了其潜在的非目标检测。这些结果确认了V8–V9区域在昆士兰沿海环境样本中对Gambierdiscus进行特异性、敏感性检测的适宜性，并验证了其在后续metabarcoding分析中的应用。

Gambierdiscus在所有检测的样本中占了184个独特序列，占2,008个ASVs中的最高读取数，总计241,824个读取（图S7）。

在系统发育分析中，通过最大似然（ML）方法，识别出了六种不同的谱系，包括已知的Gambierdiscus物种和外群属Fukuyoa。之前建立的谱系（Clade II-VI）被强烈支持（Clade II，bootstrap=100；Clade III，bootstrap=99；Clade IV，Clade V，bootstrap=100；Clade VI，bootstrap=VI）。Clade II包含了多个已知物种的参考序列，包括G. carpenteri、G. caribaeus和G. jejuensis。13个Amplicon Sequence Variants（ASVs）被包含在一个与G. carpenteri相关的单系群中。另外70个ASVs位于Clade II中，但未形成任何已知或描述物种的单系群。此外，一个包含87个ASVs的谱系在Clade II中被识别，称为Gambierdiscus sp. C2 GBR。所有87个ASVs在Gambierdiscus sp. C2 GBR中与已知Clade II物种在系统发育上显著不同，且获得中等的bootstrap支持（bootstrap=73），表明该谱系中存在之前未描述的多样性。而G. carpenteri、G. caribaeus、G. jejuensis以及70个ASVs在该群组中获得了更高的bootstrap支持（bootstrap=80）。这两组在Clade II中形成一个强烈支持的单系群（bootstrap=100），它与Clade IV是姐妹谱系。13个ASVs被分配到Gambierdiscus holmesii中，形成一个被强烈支持的单系群，与Heron Island的Gambierdiscus holmesii参考序列共同构成（bootstrap=100）。一个ASV位于Clade VI中，被指定为Gambierdiscus sp. C6，与来自日本的新的谱系（Clade VI）形成单系群（bootstrap=89）。

为了进一步研究Gambierdiscus sp. C2和Gambierdiscus sp. C2 GBR之间的遗传差异，计算了Kimura-2-Parameter（K2P）的成对距离。在Gambierdiscus sp. C2（Clade II）和Gambierdiscus sp. C2 GBR（Clade II GBR）之间，计算了成对距离（表S3和图S8）。成系内距离在Gambierdiscus sp. C2中最低，其次是Gambierdiscus sp. C2 GBR（Clade II）。系间距离在Gambierdiscus sp. C2和Gambierdiscus sp. C2 GBR之间高于系内距离，但显示出一定的重叠，进一步加强了Gambierdiscus sp. C2和Gambierdiscus sp. C2 GBR之间的密切进化关系。

为了验证Gambierdiscus sp. C2 GBR的特异性，应用了Poisson Tree Processes（PTP）和Multi-rate Poisson Tree Processes（MPTP）的物种划分模型。MPTP模型识别出了九个可能的物种，这与系统发育树中观察到的谱系（图2）密切相关，包括对Gambierdiscus sp. C2 GBR作为与其他Clade II谱系不同的实体的支持（图S9）。而PTP模型也建议了物种边界和对Gambierdiscus sp. C2 GBR作为与其他Clade II谱系不同的实体的支持，但还建议了更高的物种数量，将不同株系的同一物种视为不同的物种，并将Clade II GBR中的每个ASV视为单独的物种（图S10）。这种物种划分是因为其假设所有分支具有相同的进化速率。相比之下，MPTP考虑了系统发育树中进化速率的异质性，允许更生物意义的物种划分（Kapli等，2017）。这种方法特别适合该数据集，因为Clade II GBR中的87个ASVs表现出不同的进化速率，但仍保持进化集群。通过认识到不同谱系以不同的速率进化，MPTP最小化了人为的物种膨胀，并提供了更现实的Gambierdiscus sp. C2 GBR分类，将其视为Clade II中的一个独特群体。

单倍型网络（图3）进一步支持了系统发育树和MPTP物种划分模型，揭示了Clade II中的不同群体。在该谱系中，单倍型主要聚集在G. carpenteri、G. caribaeus和G. jejuensis的参考序列周围，而Gambierdiscus sp. C2 GBR形成一个基因上不同的密集连接群体。值得注意的是，G. carpenteri有多个主导的中心单倍型，这些单倍型占了大部分读取，并被多个单倍型包围。相比之下，Gambierdiscus sp. C2 GBR的单倍型结构更分散，缺乏主导的中心单倍型。至少有五个突变步骤将Gambierdiscus sp. C2 GBR与其他Clade II序列分开，加强了其基因上的独特性。地理上，Gambierdiscus sp. C2 GBR在Townsville和Gladstone中被检测到的频率更高，而在Hervey Bay中仅检测到两个单倍型。而Gambierdiscus sp. Clade 2在Gladstone中更为主导，其中一些主导的单倍型也在Townsville和Hervey Bay中检测到。

### 4. 讨论

本研究首次提供了昆士兰近岸海岸线的广域分子评估，揭示了物种组成中的显著地区差异以及一些新的生物地理模式。一个在Clade II中未报告的谱系，称为Clade II GBR，被识别，并可能代表一个局限于大堡礁的独立群体。Gladstone成为最丰富的物种区域，并标志着该地区首次确认的Gambierdiscus记录。值得注意的是，G. holmesii，一个已知的P-CTXs生产者，首次在昆士兰近岸沿海水域中被检测到，特别是在Gladstone和Hervey Bay的近岸水域中。这扩展了其已知的地理分布范围，从大堡礁的离岸珊瑚礁扩展到了近岸的珊瑚礁和沿海环境。尽管G. holmesii未在Platypus Bay被检测到，而Platypus Bay被认为是ciguatera的热点区域，但该物种在Hervey Bay的河口地区被检测到，这表明可能适应了河口或富含营养的沿海条件。Platypus Bay长期以来被与ciguatera爆发联系在一起，导致该地区鱼类出口被拒绝（Lewis & Endean，1983；Sydney Fish Market，2015）。之前的研究确认了Gambierdiscus的高密度和CTX-like活性，但当时未确定具体物种（Holmes等，1991；2021）。最近的确认表明G. holmesii产生M-seco-CTX4A/B，突显了该物种的毒力，并强调了其在人类可接触的沿海环境中的检测的重要性。其在历史上与ciguatera相关联的区域中被检测到，加上其毒力被确认，值得进一步监测以确定G. holmesii是否对Hervey Bay和Gladstone的毒力产生做出贡献。

本研究的结果表明，所有五种在本研究中检测到的Gambierdiscus物种在浅水环境中被检测到的频率和数量明显高于深水环境（12–18米）。G. carpenteri、Gambierdiscus sp. C2和Gambierdiscus sp. C2 GBR在浅水环境中的读取数量最高。相比之下，深水区域的样本在所有物种中显示读取数量减少，尽管G. carpenteri和Gambierdiscus sp. C2在13–17米的深度中仍存在，但相对数量较低。Gambierdiscus sp. C6和G. holmesii在所有深水区域均未被检测到，仅限于浅水环境。热图可视化清楚地展示了大多数物种对深度的明显偏好，浅水环境支持了更高的Gambierdiscus相对数量和多样性。

频率检测和相对读取数量显示了与主要物种在不同栖息地和大型藻类宿主中的相似模式，但也有一些重要的差异。例如，G. holmesii在河口处的相对读取数量最高，但在该处的检测频率较低，表明在较少的重复样本中存在高读取数量。此外，频率检测揭示了在相对读取图中未出现的稀有物种，提供了更全面的物种存在情况。这些模式表明，栖息地类型和大型藻类宿主对Gambierdiscus的物种组成和分布有显著影响。

### 5. 结论

本研究揭示了昆士兰近岸海岸线Gambierdiscus的未知多样性，包括一个潜在的基因上不同的群体（Clade II GBR）以及Gladstone地区首次确认的Gambierdiscus记录。这些发现扩展了该属在澳大利亚的生物地理分布范围，包括Gambierdiscus holmesii，一个已知的CTX生产者，其地理分布范围扩展到了更南的位置。在Clade II中观察到的高ASV多样性，很可能反映了真实的生态多样性和基因组内变异，这使得基于短读取的物种划分变得复杂。结果还突显了常用模型（如PTP）的局限性，并展示了MPTP等方法在解析微细谱系结构中的价值。未来的研究需要整合长读取测序技术、多基因系统发育（如LSU或ITS）和株系级别的毒素分析，以更好地定义物种边界并评估ciguatera风险。特别需要关注隐性或区域性的谱系，如Clade II GBR，以确定其分布、生态作用和毒力潜力。未来的研究还应探讨现场细胞密度和基因组内变异，以评估从metabarcoding数据中获得的读取数是否能可靠地作为生物数量的替代指标。此外，大型藻类宿主的关联应进一步研究，以了解宿主特异性如何影响群落组成、数量和毒素生产。尽管本研究未评估温度，但未来的研究应探讨Gambierdiscus物种及其相关大型藻类在季节性和温度梯度中的出现和数量，以更好地理解温度对它们分布的影响。最终，未来的研究应致力于开发一种多尺度、整合的监测框架，结合分子检测、毒素分析、生态数据和预测建模，这对于准确评估澳大利亚沿海水域的ciguatera中毒公共卫生风险至关重要。