自主生物发光系统：从分子机制到新兴应用

《JACS Au》：Autonomous Bioluminescence Systems: From Molecular Mechanisms to Emerging Applications

自主生物发光系统整合了荧光酶与底物合成途径，实现持续发光，具有非侵入、实时监测优势。细菌Lux系统与真菌Luz系统是研究热点，通过基因优化、代谢工程和结构解析提升亮度与多色能力，应用于单细胞成像、金属检测及生物钟研究。挑战包括低量子产率、底物限制及结构数据不足，未来需结合AI设计与代谢优化突破瓶颈。

　　自主生物发光系统——这些通过基因编码实现的平台，将荧光酶与完整的底物生物合成途径整合——已成为在生命系统中实现实时、非侵入式成像的变革性工具。与传统的依赖外部底物的生物发光不同，这些系统能够不依赖外源性底物持续发光，从而实现长期监测，并且相比荧光技术具有更低的光毒性。本文将对两种最被广泛研究的自主生物发光系统——细菌和真菌系统——进行综述，评估其分子机制、蛋白质工程策略和在单细胞成像、多色生物传感以及整个生物体监测中的新兴应用。通过比较它们的优势和局限性，我们还将指出一些持续存在的挑战，如细菌生物发光系统中较低的量子产率和真菌系统中底物供应的限制，并探讨解决这些问题的策略，包括AI引导的诱变、从头设计蛋白质以及代谢通路优化。最后，我们将展望下一代自主生物发光系统在生物医学研究、环境监测和合成生物学中的应用驱动设计目标。

生物发光现象广泛存在于多种生物体中，从细菌和真菌到海洋无脊椎动物和昆虫。发光波长通常在400-700纳米之间，但大多数自然系统主要发出蓝光至绿光范围内的光，只有少数例子在黄光和红光范围。这种分子多样性激发了它们在生物研究中的广泛应用，尤其是在对敏感性和低背景信号成像方面。生物发光反应均由荧光酶催化，该酶可能由单个基因或多个基因编码。例如，细菌荧光酶由两个基因luxA和luxB编码，而萤火虫荧光酶则由单个基因FLuc编码。生物发光系统的分类主要依据所使用的荧光素底物类型，因为许多荧光酶共享相同的荧光素。例如，许多海洋生物使用共肠腔素作为底物，通过Renilla、Gaussia和NanoLuc荧光酶发出蓝光（450-550纳米）。D-荧光素则被萤火虫和点击甲虫的荧光酶使用，产生黄光（540纳米）至橙红光（590纳米）。基于四吡咯的荧光素则在夜光藻的荧光酶中发出蓝光（470纳米），而Cypridina荧光素则通过Cypridina荧光酶发出蓝光（460纳米）。细菌荧光酶利用还原的黄素单核苷酸（FMNH?）和十四烷醛发出蓝绿光（480-500纳米）。最后，真菌荧光酶使用3-羟基hispidin作为底物，发出绿光（530纳米）。

在传统生物发光成像（BLI）中，荧光酶是通过基因表达，但荧光素必须通过外部供应（如D-荧光素、共肠腔素或Cypridina荧光素）。因此，信号动力学、持续时间和实验负担紧密依赖于底物的剂量和输送，包括重复给药、组织穿透率变化和药代动力学。相比之下，自主生物发光系统是完全通过基因编码实现的：细胞表达荧光酶和生成荧光素的酶，从而能够不依赖外部底物持续发光。在实践中，这种自主性使得可以实现纵向和实时读取，而无需外部试剂，同时引入了设计权衡，如代谢负荷、通路平衡和光谱限制。这些特性使得自主系统在需要无试剂操作的持续成像和全细胞生物报告系统中特别具有吸引力。

目前，只有两种生物发光系统，即细菌（Lux）和真菌（Luz），在关于荧光酶和内源性荧光素生物合成方面得到了充分阐明。在其他系统（如萤火虫、共肠腔素依赖系统和Cypridina荧光素系统）中，荧光酶是众所周知的，但荧光素的生物合成仍不明确。Lux系统由luxCDABE操纵子和相关的黄素还原基因组成，天然在原核宿主中发挥作用，并通过密码子优化和代谢支持被适应用于哺乳动物和植物细胞。Luz系统则是在真菌中最近发现的，它整合进植物的香豆素通路以产生其荧光素，从而在转基因植物中实现显著的裸眼可见发光。

在过去五年中，结构上的突破（如LuxC–LuxE的冷冻电镜研究）、改进的Lux操纵子（ilux/ilux2）、哺乳动物实施（co Lux）、多色Lux（Nano-lanternX/NLX）以及Luz通路的优化，推动了该领域的发展并扩展了自主BLI在不同生物体中的应用。尽管取得了这些进展，两个系统仍然面临一些持续的挑战：Lux系统存在较低的量子产率和有限的光谱范围，而Luz系统则受到底物供应限制，特别是在非植物宿主中。为了解决这些限制，已经开发出多种互补策略。这些包括通过定向诱变优化的Lux操纵子和工程化的Luz变体、通过BRET方法增强发光量子产率、通过辅因子供应工程增加FMNH?和NAD(P)H的可用性、通过工程化路径改善Luz在非植物宿主中的活性，以及通过人工智能（AI）工具（如AlphaFold3）引导的蛋白质设计。

本文对这两个系统的最新发展进行了批判性评估，比较了它们的相对优势，并提出了有针对性的策略来解决这些挑战。通过将分子见解与应用驱动目标相结合，我们旨在为下一代自主生物发光技术提供一个蓝图。随着研究的深入，这些系统有望成为生物医学研究、环境监测和合成生物学中的通用工具，实现对生命科学中多种尺度现象的实时、在体监测。

细菌生物发光系统的分子机制方面，生物发光细菌具有保守的基因簇，编码负责发光的蛋白质。这些基因通常组织在一个启动子下，并按顺序排列为luxCDABE。lux操纵子经历了进化变化，包括垂直基因转移、基因复制和删除以及基因获取。在某些谱系中，如Enhygromyxa salina，操纵子失去了luxB，导致简化为luxCDAE。在其他情况下，luxB的复制导致了额外基因luxF的加入，该基因专门结合6-(3′-(R)-myristyl)-黄素单核苷酸（myrFMN）而不是FMNH?。海洋生物发光细菌通常包含luxG，该基因编码黄素还原酶，而陆地物种如Photorhabdus luminescens则缺乏luxG，转而依赖fre编码黄素还原酶。结构上，fre从大肠杆菌和luxG从Vibrio harveyi之间具有约40%的序列同源性。三个酶参与了长链脂肪醛的生物合成，首先是转移酶（由luxD编码），将酰基-ACP或酰基-CoA转化为游离脂肪酸；其次是合成酶（由luxE编码），在ATP依赖性下激活游离脂肪酸，形成酰基-AMP中间体，该中间体与LuxE的半胱氨酸362共价连接；最后是还原酶（由luxC编码），使用NADPH将中间体还原，从而形成并释放脂肪醛产物。

结构上，细菌荧光酶形成由α-亚基和β-亚基组成的异源二聚体。α亚基（LuxA）包含活性位点，而β亚基（LuxB）稳定LuxA。LuxA和LuxB都具有TIM（β/α）8桶折叠结构，该结构与LuxA和LuxB之间具有约30%的序列同源性，并且超过95%的350个氨基酸是保守的。在Vibrio harveyi荧光酶的晶体结构（PDB：3FGC）中，FMN结合到LuxA的活性位点侧链中的Leu42、Glu43、Ala74、Ala75、Val77、Cys106、Arg107、Leu109、Tyr110、Agr125、Val173、Ala174、Glu175、Ser176、Thr179和Trp192。LuxA和LuxB之间的主要区别是LuxA在活性位点腔附近包含一个29个残基的灵活环。这个灵活环保护了中间反应免受溶剂暴露。LuxA和LuxB之间的相互作用由四个保守的螺旋束介导，涉及疏水相互作用和氢键。LuxB的Tyr151在这一亚基间结合中起关键作用，是稳定LuxA–LuxB复合物的关键残基。突变分析表明，LuxB-Tyr151Lys和LuxB-Tyr151Trp的替换会显著降低量子产率，而不会影响亚基的结合或解离。

在体内组装LuxA和LuxB需要核糖体相关暴露关键结构元素于LuxB的二聚化界面。触发因子（TF）伴侣通过防止LuxA与新生LuxB的过早结合，以及LuxB与LuxA的结合，促进亚基的相互作用。此外，当luxA和luxB基因在基因组中紧密整合时，二聚化效率会提高；相反，更大的基因间距离会导致明显的发光减少，活性降低至约60%。LuxA单独无法产生发光，必须与LuxB共同作用。为了生成功能性单体荧光酶，目前的尝试主要涉及将LuxA和LuxB融合，而不是完全去除LuxB。然而，最近的一项报告指出，在E. salina的LuxA中，LuxA单独似乎能够在没有LuxB的情况下产生发光。这种E. salina LuxA形成同源二聚体，并使用短链脂肪醛（C4–C9）作为底物，与经典的Lux系统不同，后者需要长链脂肪醛。尽管这种独特的活性，其产生的发光显著较暗，比P. luminescens的LuxAB复合物低几个数量级。

最近对细菌生物发光系统中脂肪酸还原成分（LuxC和LuxE）的冷冻电镜研究揭示了LuxC和LuxE形成四聚体复合体，催化使用ATP和NADPH生成脂肪醛。LuxE和LuxC之间的相互作用是动态的，主要由弱非极性相互作用介导，导致形成LuxC?–LuxE?复合体。LuxC的催化结构域具有一个关键的半胱氨酸残基（Cys296），位于辅因子结合域和催化结构域之间的深裂隙入口。这个残基的突变（C296A）会通过阻止底物与LuxC的共价结合而消除酶的活性。研究还表明，NADPH作为直接的共底物，在裂解硫酯键和促进脂肪醛生成的最后一步中起关键作用。

Lux系统（B）的发光速率可以通过数学模型进行描述，如在ilux2开发中所报道。这里，F代表FMNH?，A代表醛，O代表分子氧，L代表荧光酶。在体内，通过调整这些酶的结构和活性，可以进一步优化Lux系统的性能。然而，要实现更高的发光效率，还需要结合结构和计算方法进行理性设计。

真菌生物发光系统方面，其基因编码的途径是相对较新的发现。绿光发射（约520纳米）首次从Mycena luxaeterna的荧光酶-荧光素提取物中确认。随后的研究揭示了真菌生物发光系统使用单个基因编码荧光酶。2018年，从Neonothopanus nambi中阐明了完整的生物合成循环，确定了构成自主生物发光系统的四个关键基因。这些自主系统整合了四个关键酶：Hispidin合成酶（HispS）将咖啡酸转化为hispidin；Hispidin-3-羟基化酶（H3H）羟基化hispidin以生成荧光素3-羟基hispidin；荧光酶（Luz）氧化3-羟基hispidin以生成氧荧光素并发射绿光；Caffeylpyruvate水解酶（CPH）将氧荧光素水解回咖啡酸，完成循环。此外，磷酸泛酰基转移酶（NPGA）通过翻译后修饰激活HispS，确保高效的荧光素生产。在植物表达系统中，咖啡酸的生物合成由原生的香豆素通路驱动，该通路也负责产生木质素和黄酮类化合物。苯丙氨酸作为关键前体，通过苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）转化为肉桂酸。肉桂酸随后通过肉桂酸4-羟基化酶（C4H）转化为对羟基肉桂酸，并进一步通过对羟基肉桂酸3-羟基化酶（C3H）转化为咖啡酸。最近的研究表明，C3H的过表达显著增强了真菌生物发光系统的亮度。结构上，从N. nambi中分离的Luz蛋白（nnLuz）由267个氨基酸组成，分子质量约为28.5 kDa。与细菌LuxAB相比，nnLuz相对不溶，并具有预测的N端跨膜螺旋。重组的nnLuz在约pH 8.0和适中温度下表现出最佳的酶活性，而在超过30 °C时活性显著下降。由于nnLuz的晶体结构尚未解析，其活性位点中3-羟基hispidin的结合位点仍然未知，这限制了理性的蛋白质工程。尽管如此，通过共识诱变（如I3S、N4T、F11L、I63T、T99P、T192S和A199P）已经实现了稳定性改进。这些突变显著提高了nnLuz的稳定性，同时保持了其亮度。

在自主生物发光系统的颜色调节方面，调整光谱扩展了其在多色成像、生物传感和深组织应用中的价值。三种主要策略已应用于Lux和Luz系统：荧光酶活性位点的诱变、荧光素的化学修饰以及与荧光蛋白的共振能量转移（RET）。在Lux系统中，活性位点附近的FMN结合位点的突变可以改变发射峰值。例如，LuxA-D113N将发射从490纳米红移到507纳米，而LuxA-C106V诱导了约8-10纳米的位移。一个三重突变（C106V/A75G/V173A）带来约15纳米的位移，但会降低FMNH?的亲和力，从而降低亮度。这些例子展示了光谱位移与发光强度之间的常见权衡。在真菌系统中，颜色调节是通过合成具有修饰α-吡喃酮环的3-羟基hispidin实现的，这种策略在体外产生了五种不同的颜色，从蓝光到橙光，而无需改变荧光酶蛋白。然而，目前在体内合成这些修饰仍是一个重大挑战，因为尚未发现能够高效执行这种修饰的天然酶反应。虽然合成类似物的给药是可行的，例如hispidin注射可诱导植物中的短暂发光，但这种方法会使系统非自主，因为必须供应外源性底物。在真菌通路中，氧荧光素通过酶促反应水解再生咖啡酸，而通过引入类似物的回收环将需要更复杂的工程。

自主生物发光系统在生物报告应用中的价值在于它们能够实现持续的、无试剂的细胞响应监测。这种特性使得它们特别适合用于全细胞生物传感，以捕捉整合的生理效应，包括细胞毒性、代谢压力和调控网络活动。基于发光变化，生物报告格式可以分为关断型、开启型和比率型。开启型是最常见的应用，通过特定启动子或调控区域响应可诱导化合物或分子驱动发光作为读出信号。在真菌生物发光系统中，开启型应用在植物中已经成功，例如用于监测由花特异性启动子（如ODORANT1）驱动的基因表达，以及在药物治疗和病原体攻击期间由激素响应启动子（如At-RAB18、WRKY70和ORCA3）驱动的表达。这些系统提供了有价值的平台，用于长期的、无外源性荧光素添加的自发光。

在自主生物发光系统的颜色调节方面，调整光谱扩展了其在多色成像、生物传感和深组织应用中的价值。三种主要策略已应用于Lux和Luz系统：荧光酶活性位点的诱变、荧光素的化学修饰以及与荧光蛋白的共振能量转移（RET）。在Lux系统中，通过活性位点的突变可以改变发射峰值，如LuxA-D113N将发射从490纳米红移到507纳米，而LuxA-C106V则诱导了约8-10纳米的位移。一个三重突变（C106V/A75G/V173A）带来约15纳米的位移，但会降低FMNH?的亲和力，从而降低亮度。这些例子展示了光谱位移与发光强度之间的常见权衡。在真菌系统中，颜色调节主要通过荧光素类似物实现，尽管这种策略在体外成功产生了五种不同的颜色，从蓝光到橙光，但目前在体内实现仍是一个重大挑战。虽然合成类似物的给药是可行的，例如hispidin注射可诱导植物中的短暂发光，但这种方法会使系统非自主，因为必须供应外源性底物。在真菌通路中，氧荧光素通过酶促反应水解再生咖啡酸，而通过引入类似物的回收环将需要更复杂的工程。展望未来，基于人工智能的蛋白质设计工具（如ESM-3、Pinal和RFdiffusion）可能有助于识别或创造能够体内调节α-吡喃酮环的酶，从而实现自主的多色真菌生物发光在植物中的应用。

在自主生物发光系统的应用方面，它们在生物医学研究、环境监测和合成生物学中展现出广泛的应用前景。细菌生物发光系统（Lux）在细菌、哺乳动物细胞和植物中实现了单细胞成像，其亮度可与传统的荧光酶（如NanoLuc或萤火虫荧光酶）相媲美。然而，Lux在哺乳动物系统中的亮度仍不足以满足高通量或深组织成像的需求。为了增强Lux的亮度，已采用多种策略，包括密码子优化（如co Lux）、引入外源性黄素还原酶（如Frp）以及luxCDABE操纵子的定向进化（如ilux和ilux2）。这些策略改善了细菌和真核宿主的性能，但进一步的提升可能需要基于结构和计算方法的理性设计。

真菌生物发光系统（Luz）在植物中表现出色，但在非植物宿主中，咖啡酸的可用性严重限制了亮度。目前，Luz系统的性能主要集中在植物上，而其在非植物宿主中的适应性仍受到限制。为了克服这些限制，已经开发出多种策略，包括引入咖啡酸生物合成路径到非植物宿主中，以及通过人工智能辅助的蛋白质设计工具优化Luz的结构。这些策略可能在未来实现，使得真菌生物发光系统在非植物宿主中也具有更强的亮度和应用范围。

展望未来，多个策略有望改变该领域的发展方向。首先，结构引导的蛋白质工程和人工智能驱动的设计。最近对Lux组件的冷冻电镜和同源建模为针对活性位点的理性重设计打开了大门，以增强催化周转、底物亲和力和量子产率。人工智能引导的诱变和从头设计荧光酶的策略可能加速这一过程，早期的成功如LuxSit荧光酶，代表了一种合成的、非自主的生物发光平台。在分子层面，通过将一个通路的高效底物合成模块与另一个通路的荧光酶结合，可以实现混合系统。例如，理论上可以将真菌Luz荧光酶工程化为接受细菌醛衍生中间体作为替代底物，从而利用Lux通路的高效醛生成机制，反之亦然。然而，实现这种跨兼容性仍然是一个重大挑战。结合人工智能驱动的从头蛋白质设计，包括新兴工具如Boltz-2、BindCraft以及早期框架如RFdiffusion和LigandMPNN，这一方法可能在未来成为可能。

其次，代谢通路优化。通过优化Lux系统中的醛和FMNH?生成，可以降低代谢负担并提高长期应用的稳定性。对于Luz系统，将咖啡酸生物合成引入非植物宿主中可以扩大其应用范围。

第三，光谱扩展和多色成像。结合活性位点工程、荧光素类似物合成和基于BRET的设计可以将发光扩展到黄光至红光和近红外范围，从而实现深组织成像。近红外（NIR）波长特别有优势，因为生物组织在这一范围内的光吸收和散射减少，允许光子穿透更深，提高在全生物体中的成像灵敏度。并行开发正交颜色通道将有助于多参数传感。

第四，应用驱动的设计目标。对于生物医学研究：亮度超过当前10倍、毫秒级时间分辨率的近红外Lux/Luz变体。对于环境监测：可在野外条件下运行数月的低负担Lux系统。对于合成生物学：用于病毒或细胞器靶向递送的模块化基因 cassette 小于10 kb。

通过整合这些策略，自主生物发光系统有望发展为通用的、即插即用模块，用于生物监测，实现对生命科学中多种尺度现象的实时、在体观察。这些系统在未来的应用中，将不仅限于基础研究，还将拓展到更广泛的生物医学和环境应用，推动生物成像技术的进一步发展。