全氟-叔丁氧基化单糖在肝细胞癌检测中的代谢19F磁共振成像应用

《JACS Au》：Perfluoro-tert-butoxylated Monosaccharides for Metabolic 19F Magnetic Resonance Imaging in Hepatocellular Carcinoma Detection

本研究设计并合成了新型PFTB-单糖类氟-19 MRI剂，通过点击化学策略高效制备，其中PFTB-D-半乳糖（1b）因高水溶性、稳定性及对Hexokinase II的强结合能力，可实现肝癌特异性成像，并快速经肾脏排泄，显著提高生物安全性。

　　氟-19磁共振成像（¹⁹F MRI）作为一种非侵入性的癌症诊断工具，因其在体内背景信号微弱、定量分析能力优异、无辐射暴露以及穿透组织能力强等优势而备受关注。然而，¹⁹F MRI在肿瘤成像中的应用一直受到灵敏度低和肿瘤特异性不足的限制。为了解决这些问题，研究人员开发了一种新的小分子¹⁹F MRI造影剂——过氟化叔丁氧基化的单糖（PFTB-monosaccharides），特别适用于肝细胞癌（HCC）的检测。这种小分子造影剂通过点击化学方法合成，其结构中含有九个磁等效的¹⁹F原子，能够产生强烈的单线NMR信号，从而提升成像灵敏度。同时，单糖结构确保了其良好的水溶性和生物相容性，使得其在临床应用中更具潜力。

HCC是一种常见的肝脏恶性肿瘤，其代谢特征与正常细胞有显著差异。癌症细胞在快速增殖过程中会表现出增强的葡萄糖摄取和有氧糖酵解，这一现象被称为瓦尔堡效应。基于这一特性，正电子发射断层扫描（PET）利用¹⁸F-2-氟-2-脱氧葡萄糖（[¹⁸F]FDG）作为葡萄糖类似物，已成为癌症诊断的重要手段。[¹⁸F]FDG通过葡萄糖转运蛋白（GLUTs）进入细胞后，会被己糖激酶II（HK II）磷酸化，但由于缺乏2-羟基基团，无法进一步参与糖酵解过程，因此被滞留在细胞内，实现选择性PET成像。尽管PET在临床中取得了成功，但其存在一些局限性，例如由于放射性示踪剂的半衰期较短，导致合成和纯化过程复杂，需要专门的设备，且空间分辨率较低。此外，PET常与计算机断层扫描（CT）结合使用，以提供解剖结构参考，但这种组合会增加患者在频繁随访时的辐射暴露。

相比之下，¹⁹F MRI作为一种无辐射的成像技术，具有天然丰度高、稳定性强、可进行定量分析等优势。¹⁹F MRI能够实现深部组织成像，且体内背景信号极低，避免了其他成像技术可能带来的干扰。当与¹H MRI结合使用时，¹⁹F MRI可以同时提供分子和结构信息，且无需额外的辐射暴露，显著提高了成像的便捷性和安全性。然而，¹⁹F MRI也面临两大挑战：灵敏度低和体内性能不佳，包括清除速度慢和肿瘤特异性不足。目前，基于过氟碳（PFC）的纳米颗粒仍然是¹⁹F MRI的主要造影剂，因为它们具有高氟含量、被动靶向肿瘤组织和易于功能化等优点。然而，这些纳米颗粒在临床转化过程中受到稳定性差、批次一致性低和器官滞留时间长等限制，从而影响其应用前景。

为了解决上述问题，研究人员设计并合成了一系列过氟化叔丁氧基化的单糖（PFTB-monosaccharides），这些小分子具有高氟含量、良好的水溶性和生物相容性，有望成为¹⁹F MRI的高效造影剂。通过点击化学方法，研究人员将4-过氟化叔丁基炔（4-PFTB-but-1-yne）与多种1-叠氮单糖（1-azidomonosaccharides）进行偶联，得到了一系列PFTB-monosaccharides（1a–1g）。这些化合物的结构中含有九个磁等效的¹⁹F原子，能够产生强烈的单线NMR信号，从而提高成像灵敏度。同时，单糖结构确保了其良好的水溶性，使得其可以直接溶解于生理盐水中，避免了需要使用共溶剂或复杂制剂的不便。

在PFTB-monosaccharides中，PFTB-D-葡萄糖（1a）和PFTB-D-半乳糖（1b）表现出更强的结合能力，能够选择性地与HK II结合，从而实现HCC细胞的高效摄取和滞留。实验表明，这些化合物在静脉注射后能够对原位肝肿瘤进行“热点”成像，无需使用纳米载体或复杂的制剂，提高了成像的便捷性。与传统的PFC纳米颗粒相比，PFTB-D-半乳糖（1b）能够在短时间内迅速排泄至膀胱，表明其具有高效的肾清除能力，从而减少器官滞留时间，提高生物安全性。

为了进一步验证这些化合物的成像性能，研究人员通过¹⁹F MRI的体模实验评估了其在低浓度下的成像灵敏度。实验结果显示，1a和1b在0.25 mM的浓度下仍能被清晰成像，且成像时间较短，仅需256秒。此外，¹⁹F MRI信号强度与分子浓度呈线性关系，表明其具有良好的定量能力。值得注意的是，在高浓度下，1b的信号强度略高于1a，这可能与其更高的T₂/T₁比值有关，表明其在成像中的优势。

在稳定性方面，1a和1b在磷酸缓冲盐水（PBS）中表现出良好的稳定性，即使在酸性环境中（pH 5.5），其结构也未发生明显降解。这表明其在模拟肿瘤微环境时仍能保持结构完整性，有利于在体内长期监测。此外，在小鼠血浆中，1a和1b在12小时内未发生降解或信号变宽，表明其在血浆中具有较高的稳定性，且与血浆蛋白的相互作用较少，进一步提升了其作为MRI造影剂的适用性。

在生物相容性方面，研究人员通过溶血实验评估了这些化合物对红细胞的影响。结果显示，1a和1b在10 mM的浓度下仍能保持低于5%的溶血率，表明其具有良好的生物相容性。此外，通过细胞毒性实验评估了这些化合物对多种正常和癌细胞的影响，包括人胎儿肝细胞（L-02）、人乳腺上皮细胞（MCF-10A）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、人肝细胞癌细胞（HepG2）、人三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和人胶质母细胞瘤细胞（U87MG）。实验结果表明，这些化合物对细胞的毒性极低，说明其在临床应用中具有较高的安全性。

为了进一步了解这些化合物在细胞内的摄取机制，研究人员进行了分子对接实验，利用AutoDock Vina软件模拟了HK II与PFTB-monosaccharides的相互作用。结果显示，1a和1b均能与HK II结合，且结合能量分别为?8.24和?8.42 kcal/mol，表明其具有较强的结合能力。分子对接结果还显示，1b与HK II的多个关键残基形成氢键，且结合距离较短，进一步增强了其结合能力。通过表面等离子体共振（SPR）实验，研究人员验证了这些化合物与HK II的结合能力，结果显示，1a和1b的结合常数分别为3.47 μM和0.293 μM，显著低于¹⁸F-2-脱氧葡萄糖（D-Glu）的9.33 μM，表明其具有更强的结合能力。

在体内实验中，研究人员选择了PFTB-D-半乳糖（1b）用于HCC的检测，并在BALB/c小鼠中进行了¹⁹F MRI实验。实验结果显示，1b在静脉注射后1小时内能够被检测到，且在肿瘤区域信号强度较高，表明其具有良好的肿瘤靶向能力。随着时间的推移，1b的信号强度逐渐降低，但4小时后在膀胱区域出现了明显的信号，表明其具有高效的肾清除能力。相比之下，PFC纳米颗粒的排泄过程较为缓慢，通常需要数月时间，且可能伴随不良反应。

在生物安全性方面，研究人员评估了1b在BALB/c小鼠中的急性及长期毒性。结果显示，1b在37 mg/kg的剂量下，32天的监测期内未观察到任何毒性迹象、行为异常或体重下降。血液学和生化分析表明，其对血常规、肝肾功能等指标的影响均在正常范围内。此外，通过评估糖化血清蛋白（GSP）水平，研究人员确认了1b对葡萄糖代谢的潜在影响，但未发现异常变化。组织病理学分析也显示，主要器官在32天后未出现病理变化，进一步验证了其良好的生物安全性。

综上所述，本研究设计并合成了一系列PFTB-monosaccharides，其中PFTB-D-半乳糖（1b）被证明为一种高效的¹⁹F MRI造影剂，适用于HCC的检测。这些化合物通过点击化学方法合成，具有良好的水溶性、生物相容性和稳定性，且无需复杂的制剂即可实现高效的成像。与传统的PET相比，¹⁹F MRI不仅能够提供无辐射的成像，还能够实现定量分析，具有更高的安全性。此外，1b的高效肾清除能力使其在体内停留时间较短，避免了长期器官滞留可能带来的安全性问题。因此，PFTB-monosaccharides作为一种新的小分子¹⁹F MRI造影剂，具有广阔的应用前景，为非放射性代谢成像提供了一种新的设计思路。